蘆葦水解液發酵生產γ-聚谷氨酸工藝優化

徐 佳,馮昆鵬,張智強,王穎賽

(雄安創新研究院,河北雄安新區 071700)

蘆葦是一種大型多年生禾本植物,在雄安新區白洋淀的濕地環境中廣泛生長,其地上部分高度能達到6 m,可通過種子傳播或根莖分生繁殖,在短時間內積累大量的生物量[1]。目前,當地將蘆葦平衡收割后主要用于造紙和發電,經濟價值較低,導致農戶收割積極性不高,棄收的蘆葦如不開發利用,將會給白洋淀帶來新的環境污染。纖維素和半纖維素是蘆葦秸稈中的主要成分,其總含量在60%以上[2],經過物理和化學預處理,在纖維素酶的催化作用下,可水解為五碳糖和六碳糖為主的糖液,該水解液可用作微生物發酵的碳源,制備生物化工、生物材料、生物能源、生物醫藥等產品[3-4]。

γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是由L型和D型谷氨酸單體通過γ-羧基與α-氨基間的γ-酰胺鍵聚合而成的一種多肽分子[5],通常由500～5 000個谷氨酸單體組成,分子質量在100～1 000 kD之間[6]。γ-PGA是一種具有良好水溶性、能被生物降解且不會對環境造成危害的高分子多肽[7],可作為保濕劑、增效劑、增稠劑、緩釋劑、防凍劑、醫藥載體、高吸水樹脂、生物絮凝劑和重金屬吸附劑,廣泛用于農業、化妝品、醫藥、食品等領域[8-9]。

由于γ-PGA生產成本較高,因而阻礙了其廣泛應用。葡萄糖和蔗糖是大多數芽孢桿菌工業生產γ-PGA的常用碳源,近年來人們開始探索利用廉價的可再生資源來生產γ-PGA,如糖蜜、粗甘油、玉米秸稈等[10-12]。李海軍等[13]利用350 g/L的甜菜糖蜜作為碳源,發酵64 h后聚谷氨酸產量達到45.34 g/L。陳鵬程等[14]采用玉米秸稈水解液,以補料分批發酵的方式,培養54 h后得到的γ-PGA產量為25.60 g/L。這些成果為將蘆葦水解液作為生產γ-PGA的廉價營養源提供了研究依據,但γ-PGA發酵周期較長、產率不高的問題有待解決。

本研究以蘆葦水解糖液為原料制備γ-PGA,設計不同的補料策略,以5 L發酵罐上的DO值為反饋參數,建立發酵工藝優化補料策略,在較短發酵周期內提升菌體生產γ-PGA的能力,實現蘆葦秸稈向天然高分子多聚氨基酸的轉化,為利用蘆葦等廉價可再生原料發酵生產聚谷氨酸的工業應用提供科學方法。

1 材料、設備和方法

1.1 材料

菌株為雄安創新研究院保藏的枯草芽孢桿菌XII-PBS004;蘆葦取自河北雄安新區白洋淀;氫氧化鈉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、谷氨酸鈉等試劑,均為分析純;纖維素酶(Cellic CTec3,Novozymes)。

1.2 設備

HZQ-X500C恒溫搖床,上海一恒科學儀器有限公司提供;BLBIO-5GJ發酵罐,百侖生物科技(江蘇)有限公司提供;UV-1800紫外分光光度計,上海菁華公司提供;SBA-40E生物傳感儀,山東省科學院生物研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 蘆葦水解液制備

1)預處理

將蘆葦除塵去雜后晾干并切割至5 cm左右的碎段,按照進料濃度25%(質量體積比,下同)加至雙螺桿擠壓浸漬機中,控制螺桿轉速為150 r/min進行處理,擠壓后將試樣進行堿處理。處理條件:KOH用量4%,保溫溫度90 ℃,保溫時間2 h,預處理后將試樣水洗至中性進行酶解試驗。

2)酶解

將上述預處理蘆葦進行酶水解,設計單因素試驗,纖維素酶(Cellic CTec 3)的用量分別為5,10,15,20和25 FPU/g(底物),底物濃度分別為5%,10%,15%和20%(以預處理后絕干蘆葦計),反應時間為48 h,酶解體系用0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液調節pH值為4.8,在50 ℃條件下,150 r/min水浴恒溫振蕩處理。水解結束后煮沸10 min,于12 000 r/min離心10 min,取上清液,測定還原糖含量。

1.3.2 培養基配制

1)種子培養基

葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NH4Cl 2.5 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO40.4 g/L,pH 值為7.0,于115 ℃滅菌20 min。

2)基礎發酵培養基

CaCl23 g/L,K2HPO44.5 g/L,MgSO41.5 g/L,NaCl 5 g/L,玉米漿15 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸鈉20 g/L,NH4Cl 17 g/L,MnSO40.05 g/L,FeSO40.02 g/L,pH值為 7.4,于115 ℃滅菌20 min。

1.3.3 種子培養

將枯草芽孢桿菌XII-PBS004的斜面菌種接種于裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中,于36.5 ℃,200 r/min培養12 h,得到種子培養液。

1.3.4 分批發酵培養

使用5 L攪拌發酵罐進行分批發酵,按5%的接種量將種子液接入發酵罐中進行培養,攪拌轉速為800 r/min,通氣為8 L/min,培養溫度恒定為36.5 ℃,發酵周期為36 h。在發酵過程中在0 h一次性補加滅菌后的蘆葦水解液(其總還原糖的質量濃度為600 g/L)和谷氨酸鈉溶液(谷氨酸鈉的質量濃度為600 g/L),控制總糖和谷氨酸鈉的最終質量濃度均為60 g/L。

1.3.5 分段式分批補料發酵培養

使用5 L攪拌發酵罐進行分段式分批補料發酵,按5%的接種量將種子液接入發酵罐中進行培養,攪拌轉速為800 r/min,通氣8 L/min,培養溫度恒定為36.5 ℃,發酵周期為36 h。在發酵周期0 h時連續流加滅菌后蘆葦水解液,用來維持發酵液中的總糖質量濃度分別為60,40,20,10,5 g/L,直至發酵結束。在發酵周期13 h開始恒速流加滅菌后谷氨酸鈉溶液,控制流加速度為15 mL/h,攪拌轉速為800 r/min,通氣為8 L/min,培養溫度恒定為36.5 ℃,發酵周期為36 h。

1.3.6 恒定pH值分段式分批補料發酵培養

使用5 L攪拌發酵罐進行恒定pH值分段式分批補料發酵,方法同1.3.4,其中的區別為發酵周期0 h時連續流加滅菌后蘆葦水解液,維持發酵液中的總糖質量濃度為10 g/L直至發酵結束,并用20%磷酸和20%氫氧化鈉維持發酵體系pH值恒定,分別為6.4,6.6,6.8,7.0,7.2,直至發酵結束。

1.3.7 分段式溶氧反饋-分批補料發酵培養

使用5 L攪拌發酵罐進行分段式溶氧反饋-分批補料發酵培養,通氣為8 L/min,培養溫度恒定為36.5 ℃,pH值恒定為6.8。發酵初始,一次性加入滅菌后蘆葦水解液至發酵液中總糖最終質量濃度為10 g/L。發酵罐采用溶氧反饋關聯轉速和補料控制模式,攪拌轉速下限設定為200 r/min,上限設定為800 r/min。發酵周期0～12 h時,溶氧上限設定為40%,下限設定為20%,當溶氧高于40%時開始流加蘆葦水解液,溶氧低于20%時停止流加;發酵周期13～36 h時,溶氧上限設定為25%,下限設定為15%,當溶氧高于25%時開始同步流加蘆葦水解液和谷氨酸鈉溶液,溶氧低于15%時停止流加。

1.3.8 檢測方法

還原糖濃度測定:采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測定還原糖濃度。

生物量的測定:將發酵液適當稀釋后,以基礎發酵培養基為空白對照,用可見分光光度計于600 nm波長處測定吸光值,以OD600反映菌體生長狀況[16]。

發酵液中谷氨酸含量測定:使用生物傳感分析儀SBA-40E進行測量。

γ-PGA產量的測定:采用十六烷基甲基溴化銨(CTAB)比濁法測定γ-PGA產量,配置不同濃度γ-PGA標準溶液,制作標準曲線。取5 mL發酵液,于12 000 r/min 離心20 min。取3 mL上清液,加入9 mL無水乙醇使γ-PGA沉淀,并將混合物在4 ℃下保持過夜后于12 000 r/min離心20 min,棄上清液,將沉淀用2 mL去離子水充分溶解后與2 mL CTAB于室溫下反應3 min,在400 nm波長下測定吸光值,代入標準曲線,計算γ-PGA濃度[17]。

2 結果與分析

2.1 酶用量及底物濃度對蘆葦酶解的影響

纖維素酶的用量和底物濃度對木質纖維素類生物質水解影響很大,需考慮在較低的酶負載量下獲得較高的酶解效率。由圖1可知,隨著酶用量的增加,蘆葦纖維水解得到的還原糖增多,但當纖維素酶添加量從10 FPU/g(底物)進一步提升時,增長幅度趨于減緩。這主要是由于酶量過大引起競爭性抑制[18],以及木質素對酶的無效吸附所導致的。較高的底物濃度雖然可以降低成本,提高水解液總糖濃度,但底物濃度過高時,反應體系中的游離水將被限制于蘆葦中,導致傳質困難,影響酶擴散到底物的結合位點上,同時引起水解液中糖濃度的升高,對水解產生抑制作用。從圖2中可以看出,蘆葦纖維酶解的最適底物濃度為10%,在10 FPU/g(底物)的纖維素酶添加量作用下,水解液中還原糖質量濃度可達(76.64±1.74)g/L。

圖1 不同纖維素酶用量對蘆葦酶解的影響Fig.1 Effects of different cellulase dosages on enzymatic hydrolysis of reed

圖2 不同底物濃度對蘆葦酶解的影響Fig.2 Effects of different substrate concentrations on enzymatic hydrolysis of reed

2.2 分批發酵培養對菌體生長和γ-PGA產量的影響

利用蘆葦水解液對谷氨酸依賴型菌株枯草芽孢桿菌XII-PBS004進行分批發酵培養36 h,γ-PGA產量達到(32.62±1.22)g/L,生產效率為(0.89±0.03)g/(L·h)。如圖3所示,發酵過程中pH值波動比較大,不利于菌體生長和γ-PGA的合成[19]。發酵液中蘆葦水解糖和谷氨酸鈉隨著時間的延長而減少,在菌體生長的對數期和穩定期消耗較快,發酵終止時仍有較高殘留。蘆葦水解液中含有機酸和酚類細胞毒性抑制物,當發酵液中糖濃度過高時,影響菌體生長和代謝產物表達。此外,由于谷氨酸鈉的初始添加導致發酵液黏度在菌體對數生長期急劇提升,出現氧轉移限制和混合效率低的問題,阻礙了菌體生物量的增加。由于分批發酵工藝條件的不適合,致使營養物質和前體物質的利用效率低,菌體生物量和γ-PGA的產量不高,因而有必要通過調整發酵控制策略,進一步提高發酵性能。

圖3 蘆葦水解液分批發酵生產γ-PGA過程中參數變化情況Fig.3 Changes of parameters in the process of batch fermen-tation of reed hydrolysate to produce γ-PGA

2.3 分段式分批補料發酵培養對菌體生長和γ-PGA產量的影響

基于分批發酵培養中發現的問題,提出分段式分批補料的培養方式,在菌體生長期通過流加蘆葦水解液維持較低的糖濃度,并以谷氨酸鈉恒速補料的方式在菌體生長穩定期階段提供γ-PGA合成的前體物質,考察發酵過程中維持不同水解液糖濃度對菌體生長和γ-PGA產量的影響。由圖4可知,當發酵液中糖質量濃度維持在10 g/L水平時,菌體生物量OD600提升了45.76%,γ-PGA的發酵水平達到(37.72±0.03)g/L。發酵過程中控制較低的糖濃度,可使毒性抑制物一開始處于較低的濃度,保證菌株的生長活力,并促進毒性物質在菌株體內被還原成低毒性物質,提高菌株的耐受性。在適當時間補加谷氨酸鈉,除了可以避免前期發酵液黏度較高影響溶氧和傳質,還可以消除過高谷氨酸濃度對PGA合成酶的抑制。糖質量濃度控制在5 g/L時結果不佳,可能是由于補料操控難度較大引起發酵液中糖濃度波動過大。

圖4 蘆葦水解液分段式分批發酵對菌體生長和γ-PGA產量的影響Fig.4 Effects of segmented batch fermentation of reed hydrolysate on bacterial growth and γ-PGA yield

2.4 恒定pH值分段式分批補料發酵培養對γ-PGA產量的影響

相關研究表明,中性pH值條件有利于菌株生長和γ-PGA的合成,pH值顯著影響細胞的營養攝取、酶活性和細胞膜形態,從而影響代謝產物的形成[20]。如圖5所示,維持發酵液pH值為6.8時,獲得的最高菌體生物量和γ-PGA產量表明,該pH值適合菌體生長并影響其代謝,對γ-PGA的合成與釋放有正向作用。

圖5 蘆葦水解液恒定pH值分段式分批發酵對菌體生長和γ-PGA產量的影響Fig.5 Effects of segmented batch fermentation of reed hydrolysate at constant pH on bacterial growth and γ-PGA yield

2.5 分段式溶氧反饋-分批補料發酵培養對γ-PGA產量的影響

蘆葦水解液制備γ-PGA屬于高黏度好氧發酵,溶氧是該類型發酵過程中一個重要影響因素。本研究提出了分段式DO-stat分批補料發酵控制方法,基于DO值在線反饋,用以控制攪拌轉速以及營養物質和前體物質的流加速度,當底物過度消耗,DO值趨于增加時開始自動補料,DO值降低時減緩進料速率,進而維持恒定的DO水平,并保持氧消耗和供應之間的平衡。在發酵過程中溶解氧水平直接影響不同酶的合成,導致細胞代謝的變化。采用分段式DO-stat分批補料發酵,可以保持較低的底物濃度,減少反饋抑制,加強糖酵解途徑和三羧酸循環途徑在代謝過程中產生的能量[24]。與分批補料發酵相比,菌體最高生物量和γ-PGA產量分別提高64.32%和43.22%,水解糖液和谷氨酸鈉的利用率得到提升,發酵液中兩者的殘留大幅降低(見圖6)。本研究與國內外利用木質纖維素水解液發酵生產γ-PGA的工藝相比,具有發酵周期短、產量高、生產速率大的優勢(見表1)。

表1 利用木質纖維素水解液發酵生產γ-PGA的對比Tab.1 Comparison of the production of γ-PGA by fermentation of lignocellulosic hydrolysates

圖6 蘆葦水解液分段式溶氧反饋-分批補料發酵生產γ-PGA過程中參數變化情況Fig.6 Changes of parameters in the process of segmented DO feed-back control of fed-batch fermentation to produce γ-PGA by reed hydrolysate

3 結 論

本文在考察蘆葦纖維最佳酶解條件的基礎上,對枯草芽孢桿菌利用蘆葦水解液發酵生產γ-PGA進行了研究,優化其發酵工藝條件。

1)蘆葦經雙螺桿擠壓耦合堿預處理后,在纖維素酶用量為10 FPU/g(底物)和10%底物濃度的條件下,水解后還原糖質量濃度可達(76.64±1.74)g/L,可為菌株發酵生產γ-PGA提供廉價碳源。

2)分段式分批補料培養方式有利于減少底物濃度和水解液中毒性物質對菌體生長的抑制,在發酵周期13 h時開始補料加入谷氨酸鈉則有利于降低發酵液前期黏度,提高溶氧及傳質,削弱其對γ-PGA合成的抑制。將發酵過程中的pH值恒定為6.8,能進一步達到促進菌體繁殖、產物積累的雙重目的,與分批發酵模式相比,菌體生物量和γ-PGA產量分別提高56.40%和24.52%。

3)基于溶氧對聚谷氨酸發酵的重要性,設計并優化了分段式溶氧反饋-分批補料發酵調控策略,其比分批發酵有明顯優勢,增強了菌株生長水平和γ-PGA代謝及釋放能力,最高菌體生物量OD600由22.20±0.88提高至36.48±1.62,發酵36 h后γ-PGA的產量可達到(46.72±1.18)g/L,發酵生產效率由(0.89±0.03)g/(L·h)提升至(1.30±0.03)g/(L·h)。

4)以蘆葦水解糖液為原料發酵生產γ-PGA,可為蘆葦原料化高效利用、降低γ-PGA生產成本提供一種新的途徑,具有較高的商業化生產價值。

蘆葦水解液可作為廉價碳源用于發酵生產γ-PGA。本研究中建立的分段式溶氧反饋-分批補料發酵培養調控策略,可以有效提高菌體生物量和γ-PGA產量。但對該發酵體系下諸如初始底物濃度等參數的優化還不全面,后續研究將對其進行深入分析,研究蘆葦水解液中葡萄糖與木糖對菌體生長和γ-PGA合成的影響,從而進一步提高γ-PGA產量,降低生產成本。