我國入侵害蟲西部喙緣蝽的溯源分析

黃志成,劉騰騰

(山東師范大學生命科學學院,昆蟲系統分類學和進化生態學實驗室,濟南 250358)

溯源分析在入侵害蟲研究中扮演著重要的角色。通過對入侵害蟲種群的來源、傳播途徑和時間等方面進行分析,可以更好地理解入侵害蟲的來源和傳播途徑,并為制定更有效的防控策略提供參考?，F代溯源分析方法主要有DNA條形碼技術(Hebertetal., 2003)、SNP分型技術(Luikartetal., 2003)、微衛星分析技術(Selkoe and Toonen, 2006)等。DNA條形碼技術是一種基于特定的遺傳標記鑒定生物種類的方法,這種技術可以通過擴增和測序特定基因區域來確定樣本的物種身份,并與現有數據庫進行比較以確定其來源。在入侵害蟲的溯源分析中,DNA條形碼技術可以用于識別潛在的新物種或已知的害蟲種類,以確定害蟲來源,同時可以確定不同地區的害蟲種群之間的遺傳差異(Meusnieretal., 2008)。近年來,DNA參考條形碼數據庫正在不斷豐富完善。微衛星分析技術是一種基于微衛星序列多態性的分子標記技術,適用于做入侵物種的起源和擴散的研究,但需要多次PCR擴增和電泳分離、測序等步驟(Estoupetal., 2002)。SNP分型技術是利用單核苷酸多態性(SNP)的分布在基因組中的不同位置來區分不同個體的方法,可用于追蹤和鑒定生物入侵的源頭和擴散,但生成的數據量較小(Luikartetal., 2003)。后面兩種方法都受限于參考數據庫不完善,不便于大尺度協作分析。在溯源分析中可以結合多種技術手段,以獲取更加準確、全面的信息。

西部喙緣蝽LeptoglossusoccidentalisHeidemann, 1910屬于緣蝽科Coreidae喙緣蝽屬LeptoglossusGuerin Méneville, 1831,原產于北美洲西部,是針葉樹的主要種實害蟲。西部喙緣蝽的寄主植物主要屬于松科Pinaceae,在歐洲主要危害石松Pinuspinea(Feduccietal., 2009)、海岸松P.pinaster(Sousa and Naves, 2011)、歐洲赤松P.sylvestris(Lesieuretal., 2014)、地中海松P.halepensis(Kment and Baňarˇ, 2008)、歐洲黑松P.nigra(Tescari, 2004)等。在北美洲主要危害歐洲赤松P.sylvestris(Schaffner, 1967)、紅松P.resinosa(Katovich and Kulman, 1987)、花旗松Pseudotsugamenziesii(Schowalter and Sexton, 1990)等。在韓國主要危害赤松Pinusdensiflora、北美喬松P.strobus、黑松P.thunbergii和側柏Platycladusorientalis(Kimetal., 2020),韓國還報道以冬青衛矛Euonymusjaponics為食(Kimetal., 2020)。

西部喙緣蝽1～5齡若蟲的平均體長分別為3.07、4.76、8.77、13.56和15.53 mm(Leeetal., 2023)。成蟲和若蟲都以松科植物未成熟和成熟的種子為食,也以枝梢汁液為食,以雌成蟲的危害最大,可以使發育早期的種子和球果敗育,成熟種子的營養儲備降低,進而可能導致種子發芽不良、苗木活力降低(Koerber, 1963; Blatt, 1997),在北美洲和歐洲,西部喙緣蝽對松子的破壞可達70%～95%(Kimetal., 2020)。西部喙緣蝽還可攜帶病原真菌Sphaeropsissapinea(Fr.) [=Diplodiapinea(Desm.)]的孢子,導致松樹針葉和莖皮壞死,幼苗枯萎(Musolinetal., 2022)。

西部喙緣蝽在原產地美國加利福尼亞州1年1代,在墨西哥每年最多可以發育3代(Aukema, 2007)。在韓國西部喙緣蝽1年1代,成蟲在5月中下旬出蟄,交配后在寄主針葉上產一排約5～15枚卵,10～15 d后若蟲孵化;到6月中下旬,1齡若蟲附著并吸食針葉;2齡若蟲轉移至球果上以種子為食,成蟲活躍到10月中旬左右,從10月下旬開始越冬(Kimetal., 2020)。受聚集信息素的影響,西部喙緣蝽常在松散的樹皮下越冬(Dennys, 1927),也可以在建筑物內集群越冬(Spencer, 1942; Schaffner, 1967)。Kitajimaetal.(2022)發現早春時節西部喙緣蝽傾向于吸食針葉樹的雄球花,以獲取更多的熱量。

西部喙緣蝽的自然分布范圍覆蓋北美西部,廣泛分布在不列顛哥倫比亞省(British Columbia)到墨西哥、太平洋海岸到科羅拉多州(Colorado)的地區(Koerber, 1963)。自二十世紀下半葉以來,西部喙緣蝽從北美西海岸向東擴展(Hoebeke and Wheeler, 1982;McPherson, 1990),并在2008年到達北美東部的新斯科舍省(Nova Scotia)(Scudder, 2008)。20世紀90年代末,西部喙緣蝽被引入意大利北部(Tescarietal., 2001),在隨后的10年里,歐洲多國陸續報道了此種害蟲。西部喙緣蝽在亞洲也在逐漸擴散,已經入侵到中亞(Barclay and Nikolaeva, 2018)和東亞地區,日本(Ishikawa and Kikuhara, 2009)和韓國(Ahn, 2013)都有分布報告。Zhu(2010)報道我國首次在天津口岸截獲西部喙緣蝽,此后我國海關多次發現并截獲該蟲(徐梅, 2014),但并未確認該蟲已在我國定殖。馬如玉等(2023)在威海和青島的黑松上發現西部喙緣蝽,為我國境內首次報道。除原產地外,西部喙緣蝽現在已經廣布于歐洲(Farinhaetal., 2021)、亞洲、北非(Benetal., 2013; Gapon, 2015)、南非(Heyden and Faúndez, 2020)和南美洲(Faúndez and Rocca, 2017; Kun and Masciocchi, 2019; Heyden and Faúndez, 2020)。各國首次記錄時間見表1。

表1 西部喙緣蝽入侵的國家和首次報道文獻

最近,山東煙臺多地發現西部喙緣蝽的成蟲和若蟲,表明該種已經在國內定殖。目前國內對西部喙緣蝽的入侵來源、生物學特性等缺乏了解,這一狀況不利入侵檢疫、種群監測以及防治工作的開展。本研究以野外采集的西部喙緣蝽標本為研究材料,以COI基因為標記基因,利用系統發育和單倍型對其入侵來源進行了分析討論,為更好地制定規制措施,開展防治工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集

本研究所用3頭西部喙緣蝽成蟲(2♀,1♂)、1頭3齡若蟲(♂)標本于2022年采集于煙臺市沿海防護林和煙臺市牟平區昆崳鎮單耳山村。采集后浸泡于無水乙醇中,-20℃保存備用。

1.2 形態觀察

使用佳能Canon 80D單反相機、100 mm微距鏡頭在野外拍攝生態照片,制作成干制標本后使用萊卡Leica S9E體視顯微鏡觀察研究形態特征。綜合山東若蟲標本和韓國種群的若蟲資料(Leeetal., 2023),對各齡若蟲做了描述。

1.3 總DNA提取

采用北京諾貝萊生物科技有限公司生產的快速DNA提取試劑盒,提取純化昆蟲組織的DNA,參照試劑盒的說明書進行操作,使用Buffer SL和蛋白酶K溶液對取下的腹部和前足組織進行56℃裂解,然后使用Buffer VL孵育并混合無水乙醇將樣品過柱處理,經過WB1和WB2漂洗離心進一步純化后,使用Buffer EB將樣品上柱,然后通過12 000 rpm的離心操作將其洗脫得到純化后的DNA模板,保存在-20℃的低溫環境中備用。

1.4 COI基因擴增、序列測定和分子鑒定

使用通用引物LCO1490/HCO2198進行DNA擴增(Folmeretal., 1994),反應擴增體系為25.0 μL,其中2×UrTaq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL,dd H2O 8.5 μL,反應程序:95℃預變性2 min,95℃ 20s,53℃ 20 s,72℃ 1 min,35個循環;72℃延伸2 min,COI基因PCR擴增產物大小為685 bp。產物4℃保存,1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測確證后,送擎科生物科技有限責任公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫、BOLD數據庫(Ratnasingham and Hebert, 2007)中進行比對,鑒定煙臺標本所屬物種,并與青島西部喙緣蝽序列做同種驗證。

1.5 序列和單倍型分析

測序結果保存在NCBI的GenBank數據庫中,登錄號為OQ457541～OQ457544,下載GenBank數據庫中西部喙緣蝽COI基因的所有公共序列,通過MEGA 11軟件(Tamuraetal., 2021)中的MUSCLE功能進行對齊,去除前后冗余堿基,得到566 bp數據集,使用Sequence Data Explorer功能分析堿基突變位點。

使用軟件DNAsp V6(Rozasetal., 2017)計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity, Pi)和單倍型多樣性(Haplotype diversity, Hd)。在MEGA 11(Tamuraetal., 2021)中以喙緣蝽屬的Leptoglossusclypealis(登錄號KY818713)為外群,采用最大似然法(ML)構建系統發育樹,使用ChiPlot(https://www.chiplot.online)作圖。使用NETWORK 10.2.0.0軟件(Bandeltetal., 1999)繪制單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 形態特征和危害

成蟲體長約17～20 mm,寬約5～7 mm(測量3頭成蟲標本)(圖1)。體紅褐色,長橢圓形,密被半直立剛毛。頭長約3 mm,向前延伸,兩眼遠離前胸背板前緣,單眼紅色;頭頂黑色,中間有 1道紅色條紋;喙較長,至第4腹節;觸角第1節、第4節黑色。前胸背板肩角鈍圓,前胸背板前緣有兩塊對稱分布的白色斑塊,上面有數個黑色斑點;小盾片整體深褐色,與前胸背板相接處黑色;前翅革質部與膜質相交處的翅脈為對稱橫向分布的白色的“h”形結構(圖2);膜片深褐色。前兩對足腿節內側有鋸齒,每排2～4個,后足腿節外側黑色,內側有兩排鋸齒,每排6～8個;后足脛節擴張成兩側幾乎對稱的葉狀,擴張部分有白色斑點對稱分布,除靠近關節處外整體為黑色。頭、胸部腹面均勻分布黑色斑點,腹部的黑色斑點密集分布在腹中線兩側,數量向后逐漸遞減。

圖1 西部喙緣蝽成蟲形態

圖2 西部喙緣蝽關鍵識別特征

若蟲全身紅褐色,其中5齡若蟲體色較灰暗。1齡、2齡若蟲的腹部較窄,與胸部等寬,從3齡若蟲開始腹部寬度大于胸部;3齡若蟲各腹節分界明顯,4齡若蟲腹部較3齡若蟲飽滿,顏色鮮艷;若蟲第4～6腹節之間有顯著的黑色臭腺孔,成蟲消失。西部喙緣蝽在山東主要危害黑松和赤松,7月至8月中旬可見成蟲和若蟲在松樹的嫩梢和1年生球果上吸食為害(圖3),導致嫩梢枯萎發黃、長勢減弱,球果發黃、變形、開裂。

圖3 西部喙緣蝽在赤松球果上

2.2 分子鑒定

采集的4頭標本的COI基因經DNAsp V6軟件處理后確定屬于同一單倍型,在NCBI數據庫和BOLD數據庫中的比對結果顯示,這些標本的COI基因序列與西部喙緣蝽高度相似(NCBI:99.64%～100%,BOLD:99.23%～100%),證實屬于同一物種。

2.3 單倍型分析

通過單倍型分析發現,全球存在10種不同的單倍型,可大致分為5個地理種群(北美西部、北美東部、歐洲、韓國、中國山東)(表2,圖4)。山東煙臺的序列OQ457541～OQ457544無新的突變位點,與單倍型H_2一致;山東青島的OM883865屬于H_8,OM883918和OM883922分別為新發現的單倍型H_9和H_10(表2),H_9與H_8之間只有1個突變位點,H_10和H_4之間有2個突變位點(表3)。

圖4 西部喙緣蝽COI基因不同單倍型的世界分布

表2 西部喙緣蝽COI基因不同單倍型序列的GenBank登錄號和地理分布

在13個位點檢測到堿基變異,其中以C/T顛換和A/G顛換為主(表3),這些變異大多屬于同義突變,這種變異可能使得基因更穩定(朱彥彬等, 2012)。所有單倍型均有明顯的A+T偏向性,A+T的平均含量為63.7%,G+C的平均含量為36.2%,此為昆蟲線粒體基因序列組成的一種共有特性(Nei and Kumar, 2000)。

H_3、H_5和H_6的采集地都位于加拿大不列顛哥倫比亞省(British Columbia),屬于北美西部喙緣蝽原生分布范圍(表2,圖4)。結合西部喙緣蝽的傳播過程,可以推測H_3、H_5和H_6屬于起源于北美西部原生地的初始單倍型。在煙臺種群發現之前,H_2分布于北美(加拿大、美國)、歐洲(德國、匈牙利)和韓國(表2,圖4),煙臺種群可能是從以上地區傳播而來。H_2在北美的采集地為安大略省(Ontario);H_4已入侵至韓國,在北美的采集地位于新斯科舍省(Nova Scotia)、安大略省(Ontario)和緬因州(Maine)(表2,圖4),以上表明H_2和H_4的傳播源頭都在北美東部。

H_1的采集地新斯科舍省(Nova Scotia)雖處于北美東部(表2,圖4),但經過與初始單倍型(H_3,H_5,H_6)比對后發現,突變位點有3～5個(表3),親緣關系較遠,猜測北美西部還有初始單倍型尚未被發現。

單倍型網絡圖能夠更加清晰地展示不同單倍型之間的遺傳距離及其分布情況。在單倍型網絡中,H_3、H_6～H_10與H_4聯系密切;H_2已入侵至全球多個地區,表明H_2和H_4在西部喙緣蝽的入侵過程中發揮了較大的作用;H_1可能還存在1個初始單倍型(mv1)。除山東煙臺外,在其它入侵地(北美東部、歐洲、韓國、中國青島)均有新的單倍型產生(圖5),表明西部喙緣蝽可能會通過基因突變以適應新的生境。

圖5 西部喙緣蝽COI基因單倍型網絡圖

單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)能夠衡量一個群體線粒體DNA(mtDNA)變異程度,Hd和Pi值越大,群體的遺傳多樣性則越高(Smithetal., 2006)。中國種群的核苷酸多樣性Pi為0.00423,在所有地區中最高;單倍型多樣性Hd為0.714,在各地區中處于較高水平(表4)。這表明西部喙緣蝽中國種群具有較高的遺傳多樣性,其傳播來源可能涵蓋數個地區。

表4 西部喙緣蝽不同地理種群COI基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性分析

2.4 遺傳距離和系統發育分析

在系統發育樹中,H_2與H_5共同組成一個進化分支,它們之間的遺傳距離為0.18%,這表明它們的親緣關系比較接近。H_4與H_3、H_6在系統發育樹中處于同一個進化分支,它們之間的遺傳距離同為0.18%(圖6),表明H_3,H_6和H_4之間的親緣關系非常接近。

圖6 使用ML法對西部喙緣蝽COI基因不同單倍型序列構建的系統發育樹

H_8現分布于青島和韓國。H_9與H_8構成了系統發育樹中的一個分支,遺傳距離為0.18%,親緣關系非常接近。H_10與H_4的遺傳距離最近,為0.36%(圖6)。以上結果表明,青島種群與韓國種群具有較高的遺傳相似性。

山東煙臺兩個采集點的單倍型均為H_2(登錄號OQ457541～OQ457544),和青島的單倍型H_8(登錄號OM883865)、H_9(登錄號OM883918)和H_10(登錄號OM883922)之間的遺傳距離較遠為0.54%～0.72%,在系統發育樹中分別處于不同的進化分支(圖6),表明兩地的西部喙緣蝽可能來自不同的地區。以上分析表明,我國西部喙緣蝽種群可能來源于多次獨立入侵事件,同時在國內發生了小范圍的擴散遷移。

3 結論與討論

通過本次分析,發現西部喙緣蝽在新入侵地(包括北美東部、歐洲、韓國和中國)的COI基因會進化出新的單倍型。這些單倍型主要是由同義突變引起的,這些突變有助于使基因更加穩定,以適應當地的環境。西部喙緣蝽在2010年前后入侵東亞地區,我國于2010年在天津海關首次截獲西部喙緣蝽,推測西部喙緣蝽入侵膠東半島最長時間不超過12年,入侵時間較短,且采樣范圍較小,僅限于昆崳山周邊地區,這可能是致使采集自煙臺的樣本中并未發現任何突變位點的原因。此外,西部喙緣蝽擁有較強的飛行能力(Farinhaetal., 2023),能夠依靠寄主植物在入侵區域內傳播(Lesieuretal., 2019),個體之間可以頻繁進行基因交流,這也可能是導致未能發現新單倍型的原因之一。

北美地區擁有豐富的森林資源,是世界上主要的木材出口地區之一,其原木和鋸材的出口量居于世界前列(劉瑩, 2015)。結合以上分析,可以看出北美東部在西部喙緣蝽在向世界其他地區擴散的過程中扮演了“橋頭堡”的角色(Lesieuretal., 2019)。

山東作為全國木材進口大省,其進口來源涵蓋5大洲的80多個國家和地區,在2011-2016年期間,山東口岸截獲的有害生物來源國主要為新西蘭、烏克蘭、羅馬尼亞、俄羅斯和美國,其中從美國和俄羅斯進口的木材中截獲的有害生物種類隨著檢疫力度的加強逐年增加(王凱等, 2017)。綜合單倍型分析結果和山東口岸截獲情況,推測煙臺種群的入侵源頭為北美東部地區。

Zhuetal.(2014)對西部喙緣蝽在全世界的潛在分布區進行預測,研究顯示東亞地區高度適宜西部喙緣蝽生存,西部喙緣蝽的分布受其針葉植物寄主分布區和氣候的限制。趙力等(2015)曾對西部喙緣蝽和紅肩美姬緣蝽Jaderahaematoloma(Herrich-Sch?ffer, 1847)在中國的潛在分布區進行模擬,該研究顯示基于美國西部種群構建的模型,膠東半島對西部喙緣蝽的適生性較高,這一預測已被本研究證實。煙臺市和青島市地處膠東半島,瀕臨黃海、渤海,與韓國、美國、日本和歐盟貿易往來頻繁,且膠東半島分布有大面積的黑松、赤松,有利于西部喙緣蝽的入侵和定殖,山東內陸山區,如蒙山、泰山等也廣泛分布著松屬植物,為西部喙緣蝽向內陸繼續擴散提供了有利條件;紅肩美姬緣蝽的入侵和擴散也應引起重視,此蟲已在臺灣形成穩定種群(Tsaietal., 2013),其寄主無患子科Sapindaceae植物在中國西南、東南、華南地區廣泛分布,為其入侵提供了便利條件,因此需要提高警惕并加強防控。

西部喙緣蝽主要危害種實,影響松林的自主更新,還能給松科植物帶來更多的病害,對針葉林經濟和生態環境有一定的威脅。本研究推測了我國西部喙緣蝽種群的入侵來源。山東種群有兩個不同的入侵來源:煙臺種群可能來自北美東部,青島種群可能來自韓國。由于SNP分型技術和微衛星技術受限于世界西部喙緣蝽基因數據庫的不足,本研究采用DNA條形碼技術對西部喙緣蝽進行溯源分析。為了對西部喙緣蝽的入侵過程進行更加明確地溯源分析,將來需要擴大國外標本的采集范圍,同時深入調查國內入侵種群的分布現狀,提取國內外不同種群的基因組信息,使用更加豐富的分子標記進行相互驗證。

致謝：感謝論文中使用的公共序列的作者和單位,感謝青島農業大學王俊平提供西部喙緣蝽青島種群的公開序列。感謝當地林場、保護區管理局提供的便利和協助。