花耳屬1 個中國新記錄種
——Dacrymyces dictyosporus*

喬 婷，戴 璐，張黎光，劉 愚，霍文嚴，賀雪蓮，祁 鵬，路鵬鵬，李峻志

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

花耳屬（Dacryomyces） 隸屬于花耳綱（Dacrymycetes） 花耳目（Dacrymycetales） 花耳科（Dacrymycetaceae），最早于1816 年由NEES 建立，當時只容納了1 個單一的物種[1]。隨著研究的深入，又發現了一些新種，其屬內物種逐漸增多[2-5]。目前，根據真菌分類索引（Index Fungorum） 已經確定了114 個花耳屬分類群，廣泛分布于世界各地，主要集中于歐洲、美洲、亞洲和大洋洲[6-9]。花耳屬中的物種相對混雜，其中包括了很多未分類于花耳科中其他屬的類群[10]。隨著分子生物學的發展，分類學家對花耳科物種的系統發育關系進行了重新評估，結果表明，花耳屬物種具有高度多樣性，但目前花耳屬的幾個類群和其他屬之間的系統發育關系還未有很好的數據支持，而且用于區分不同分支的表型特征有較多重疊[11-12]。因此，在鑒定該屬物種時需謹慎，避免分類混亂。

截至目前，有7 個花耳屬真菌在中國被發現，包括Dacryomyces dendrocalami Oberw，Dacryomyces duii B.Liu & J.Z.Cao，Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian，Dacryomyces pengii （B.Liu & L.Fan） A.Savchenko，Dacryomyces Sichuanensis B.Liu& L.Fan，Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Yunnanensis B.Liu & L.Fan。但部分物種僅以形態學特征作為分類依據，缺乏分子生物學相關數據[5-6，13]。吳峰等[14]于2022 年首次結合形態學與分子生物學，鑒定了我國境內的2 個花耳屬新種Dacryomyces Cerebriformis F.Wu & Y.P.Lian 和Dacryomyces Sinostenosporus F.Wu & Y.P.Lian，獲得了中國花耳屬樣品的分子生物學數據，豐富了花耳屬物種的多樣性。

花耳屬擔子果呈無柄的枕狀、角狀，有時具柄，具有較均勻的菌絲結構，有兩性膜或圓柱形中等分化的不育皮層，膨脹細胞比Heterotextus 少[15]。該屬物種通常生長于死樹、樹樁、倒下的樹干，或被子植物、裸子植物的樹枝上，在木材分解過程中起關鍵作用，同時可引發褐腐病[16]。目前對花耳屬物種的研究主要集中在分類學階段，對其次生代謝產物及應用所知甚少。MIERAUV 等[17]從花耳屬物種中分離獲得2 種新的抗生素代謝物dacrymenone（1）和VM 3298-2 （2）；其中倍半萜類化合物dacrymenone（1） 表現出較弱的抗菌和抗真菌活性，而VM 3298-2 （2） 表現出細胞毒性和抗真菌活性。BULAT[18]為了解花耳屬部分物種擔子果呈現黃色或橙色的原因進行了研究，發現隨著光照強度的增加，色素產生的速度加快，相同光照強度條件下，擔子果顏色趨于一致。以上研究結果為后續開展花耳屬物種代謝產物的研究提供了思路。

秦嶺地區大型真菌資源豐富，但花耳屬物種報道較少，通過對采自秦嶺的1 份樣本進行了形態學和分子生物學鑒定，結果顯示該樣本為Dacrymyces dictyosporus。這是首次在中國境內發現D.dictyosporus，因此確定其為中國新記錄種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮Dacrymyces dictyosporus （中文名未定） 擔子果樣品，于2021 年11 月5 日采自陜西省寶雞市太白縣太洋公路 “K 14+500” 處的高山草甸（107°27′93.0″E，33°98′87.3″N，海拔2 089 m），編號為20210556。采集后置于硅膠中干燥，后將其保藏于陜西省微生物研究所秦嶺菌物標本館（SXIM） 中。

1.2 形態學觀察

于自然環境下對子實體樣本的宏觀形態和生境進行拍照記錄，并將其置于刻度板上，觀察和記錄擔子果的形態特征，表面是否具附屬物，受傷后是否變色。詳細描述菌肉顏色、氣味等特征。

1.3 顯微形態學觀察

將干燥的標本組織手動切片后，使用5%的KOH 復水，在光學顯微鏡下觀察其顯微特征。隨機選取20 個成熟的擔孢子、擔子、皮層菌絲、內部菌絲進行測量和拍照。

1.4 分子生物學分析

1.4.1 DNA 提取及PCR 擴增

采集的樣品帶回實驗室后立即取樣放入DNA 保存液中。進行分子生物學分析時，從DNA 保存液中取出20 mg 新鮮擔子果，在液氮中充分研磨，按照Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司） 提取DNA。使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 對基因組DNA 進行PCR 擴增。20 μL PCR 反應體系為：2×Mix 10 μL，上游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1） 1.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 5 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環；72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物。

1.4.2 DNA 純化及測序

使用快速瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司） 對PCR 產物進行純化回收，檢測合格后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.4.3 系統發育分析

使用DNASTAR 軟件對雙向測序結果進行質量檢測和拼接[19]。將獲取的ITS 序列在NCBI 中進行BLAST 比對，下載與之一致性較高的序列，以松乳牛肝菌（Suillus pictus） 作為外類群[20]，利用MEGA 5 軟件中的最大似然法，以Kimura-2parameter 模型構建系統發育樹，Bootstrap 為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

采集樣本20210556 的形態特征詳見圖1。

圖1 樣本擔子果形態Fig.1 The basidiocarp morphology of sample

如圖1 所示，該菌擔子果散生于樹干表面，直徑1～3 cm 不等。幼時膿包狀、角狀或枕狀，呈透明至淺黃色；隨著擔子果生長，逐漸呈扇形，表面腦狀，具柄。新鮮時多呈亮橙色至橙色，軟膠質，干燥時橙黃色至暗橙色。其菌絲、擔孢子顯微結構見圖2。

圖2 樣本顯微結構圖Fig.2 Microstructure diagram of sample

由圖2 可知，擔子果幼時皮層相對清晰，內部菌絲具細長的管腔，隔生，無明顯鎖狀聯合。擔子棍棒狀近圓柱形，大小為（31～58）μm ×（6～10） μm，成熟后出現分叉；擔孢子寬，呈鈍梭形、蠶蛹形、梨形；頂端通常有小突起，具1～7 個橫隔，經5%的KOH 處理后呈黃色；大小為 [（15.2） 19 ～22（26.5）] μm × [（6）8～10 （11）] μm，平均長為20.2 μm，平均寬為8.6 μm，Q 值（擔孢子平均長度與寬度之比） 為2.35。擔孢子可通過胚管萌發，呈罕見的近球形至寬卵形，大小為（17.0 ～19.5） μm ×（11.5～13.0） μm。

根據形態學特征，初步將該物種鑒定為Dacrymyces dictyosporus。該種主要分布于美國、日本、新西蘭、中國等。常于秋季散生于針葉林裸子植物腐木上。

2.2 系統發育分析結果

基于花耳屬12 條ITS 序列（其中11 條序列來自GenBank），以松乳牛肝菌1 條序列（序列編號為AY854069.1） 為外類群構建的系統發育樹見圖3。

圖3 基于ITS 的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

如圖3 所示，試驗樣品20210556 與日本和美國報道的D.dictyosporus （AB712454.1，MK050629.1）序列聚為一支，且支持率高達98%；同時與該屬較相似物種D.chrysospermus 的5 個序列處于不同分支。因此在分子水平上能將Dacrymyces dictyosporus與相似物種D.chrysospermus 明顯區分開。系統發育分析結果與形態學鑒定結果一致。

3 結論與討論

對采自秦嶺的1 個真菌物種的形態學特征進行了詳細描述，并結合分子生物學手段進行綜合鑒定，顯示該樣本為Dacrymyces dictyosporus。通過文獻檢索發現，D.dictyosporus 是首次在中國境內被發現，因此確定其為中國新記錄種。

D.dictyosporus 是花耳屬一個獨特的物種，其擔子果大，厚壁盤孢子，無鎖狀聯合[8，20]。根據新鮮擔子果的宏觀形態特征，樣品與金耳、Tremella mesenterica 相比，其擔子果形狀、顏色、質地等方面較為相似，但擔子和擔孢子的形狀、大小、內部菌絲是否有鎖狀聯合等方面差異較大。如D.dictyosporus 是由單型菌絲組成，其擔孢子主要呈鈍梭形、梨形，大小為[（22.5）25～28 （30）] μm ×[（9）10～12（13.5）] μm[21]；而金耳和T.mesenterica均是由自身菌絲和寄主菌絲形成二型態菌絲結構。金耳的酵母狀分生孢子多呈亞球形、寬橢球形，大小為[8.3～9.5（9.7）] μm × [6.8～7.6（8.0）] μm；T.mesenterica 的擔孢子寬，呈橢球形，大小為[13～16（22）] μm ×[9.3～10.6（12.1）] μm[22-23]。

D.dictyosporus 與掌狀花耳（D.chrysospermus）形態特征十分相似，尤其是擔子果及擔孢子的結構，均會出現少數近球形擔孢子，但擔子果的形狀和大小及菌絲鎖狀聯合方式不同。