麗水白云山和南明山及周邊地區可培養大型真菌的鑒定*

劉 昆，吳春玲，宋小亞，蔣 俊，路新彥，應國華

（麗水市農林科學研究院，浙江 麗水 323000）

我國約有大型真菌資源17 000 種，僅有少量類型被發現，大部分類群尚未發現[1]。我國有可食大型真菌近1 000 種，可商業規模栽培的僅60 種左右，大量大型真菌資源未被挖掘利用[2]。野生資源需要經過分離、鑒定、馴化栽培，才能將其由野生生長狀態變為可人工栽培的狀態。從大型真菌的無性、有性組織或其生長基質中分離到的菌絲體，是食（藥）用菌產業開發利用的基礎。但由于野外環境復雜，容易滋生多種真菌，因此分離過程中常因其他絲狀真菌的影響而出現分離錯誤、菌種污染等情況，造成培養的菌株與最初標本不符，從而影響后續馴化利用。因此，明確分離培養所獲得菌株的準確名稱，是后續研究的基礎。

麗水市地處浙江省西南端山區，位于118°41′～120°26′E，27°25′～28°57′N，面積1.73 × 106hm2，境內90%以上地區是山地，分布有甌江、錢塘江、閩江、飛云江、靈江、福安江等眾多水系，以中亞熱帶海洋性季風氣候與丘陵山地立體氣候為主，森林覆蓋率為81.7%，是華東的重要生態屏障，物種多樣性居全省之冠[3]。得天獨厚的自然資源與氣候條件，孕育出豐富的物種和植被類型。大型真菌作為麗水市生態循環的分解者，在生態平衡中占有不可或缺的地位，是生物多樣性的重要組成部分。對麗水市野生大型真菌資源進行調查，摸清資源概況，不僅有益于當地生態環境，也可為大型真菌資源保護利用提供理論基礎。

目前，在海南、山東、貴州等地均開展過大型真菌資源的調查研究，期望大型真菌資源在生態保護、農業資源利用、食品藥品生產等方面發揮作用。如MA 等[4]對海南的木腐大型真菌資源進行了報道，共發現702 種木生大型真菌，包括食用菌22 種、藥用菌71 種、有毒蘑菇6 種。王敏等[5]、鄧春英等[6]分別對貴州省內的食用菌與有毒蘑菇資源進行調查，共發現481 種野生食用菌，140 種有毒蘑菇。蘇陽等[7]報道，山東省有大型真菌資源557 種，其中食用菌118 種、藥用菌184 種、食（藥） 兼用菌57 種。據文獻記載，自1980 年起，麗水市已經開始對大型真菌資源進行調查，但當時僅收集了部分木腐菌標本，并未對生態環境、真菌生活習性、有毒蘑菇的危害及價值進行詳細研究[8]。1997 年，孫培基等[9]報道，浙西地區（包括浙江泰順縣） 有大型真菌468種。2012 年，顧新偉等[10]調查顯示，浙南山區（包括永嘉縣、文成縣、泰順縣） 擁有大型真菌1 100多種。近年來，隨著資源調查方法與標本鑒定技術的迅速更新，部分學者開始利用網絡化調查與分子鑒定技術對麗水轄區內的大型真菌資源進行更加詳細與科學的研究。如趙端林等[11]在景寧縣的望東垟、大仰湖2 個保護區內采集標本1 018 份，鑒定出195種大型真菌，包括8 個國內新記錄種和4 個新種或新亞種。孫其偉等[12]在慶元縣采集到標本286 份，鑒定出149 種大型真菌。趙承剛等[13]對縉云縣境內大型真菌進行調查，獲得標本203 份，鑒定出132個種。但關于麗水白云山與南明山兩地大型真菌資源分布情況未見相關報道，對兩地可培養大型真菌資源的相關研究也較少。試驗通過對白云山、南明山及周邊地區可培養野生大型真菌資源進行分子生物學與形態學鑒定，明確其分類地位，評價其利用價值，以期為今后的馴化栽培和資源開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 野外調查與菌株采集

白云山與南明山分別位于麗水市城區北側與南側，占地面積分別為2 848 hm2、1 177 hm2，分別建有白云國家森林公園與南明山風景名勝區，生態環境良好。兩地年平均氣溫為18 ℃左右，4 月～10 月為雨季[14-15]。對白云山、南明山兩地采用踏查法開展大型真菌野外調查與樣品采集[16]，時間主要集中在2010 年至2021 年間每年的5 月至9 月。并對慶元的百山祖和五嶺根、云和鳳凰山、景寧漁際坑、松陽箬寮原始林等地進行適時采集。采集時記錄采集編號、地點、時間、植被類型；新鮮子實體形狀、大小、顏色、氣味、傷變情況、生長基質等內容，并使用數碼相機進行圖片拍攝。新鮮樣品采集后帶回實驗室進行分離、干制與保存。

1.2 菌株干制與菌絲體分離

新鮮子實體連同采集標簽一同放入報紙中，在45～50 ℃條件下烘干，用于標本保藏與顯微觀察。

新鮮子實體表面使用75%酒精進行消毒后，將子實體切開（耳狀子實體撕開子實層），使用手術刀切取部分子實體組織塊，接種于含有抗生素的葡萄糖馬玲薯瓊脂（PDA） 平板中，于25 ℃條件下培養。期間及時觀察和記錄，待菌絲開始生長后切取菌落前端菌絲體進行純化培養，連續純化3 次。

1.3 菌株鑒定

采用ITS 序列比對與形態鑒定相結合的方法進行物種鑒定。對于保藏時間較久，只有菌絲體的菌株以分子生物學鑒定為主。

將純化后的菌絲體接種到鋪有賽璐酚膜的PDA平板中，25 ℃培養菌絲體。當菌絲長滿平板或培養15 d 后收集菌絲體。使用北京百泰克公司的真菌基因組試劑盒提取總DNA。ITS 序列擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。25 μL 擴增反應體系：2.5 μL 10 × Buffer，1 μL dNTP （2.5 mmol·L-1），上下引物各1 μL （10 μmol·L-1），0.3 μL Taq 酶（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，18.2 μL ddH2O。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果為單一條帶的PCR 擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行TA 克隆測序。使用NCBI 數據庫中的BLAST 在線程序對所獲得的序列進行比對分析。

形態學觀察包括采集過程所記錄的宏觀形態，以及菌蓋表皮、擔子、孢子、囊狀體等顯微結構特征。將ITS 比對結果與形態特征結合進行物種鑒定，兩者結果一致判定為有效分離菌株，鑒定結果不一致的判定為無效分離菌株。對于僅有菌種的菌株，查閱相關書籍文獻，根據分子鑒定結果與菌絲形態判斷是否為有效分離菌株。

1.4 菌株種名確定

根據第十版Dictionary of the Fungi （《真菌詞典》）[17]分類系統確定分類地位。物種的拉丁學名以真菌物種數據庫Index fungorum[18]收錄的最新名稱為準。中文名稱參考《中國大型菌物資源圖鑒》[19]和《中國生物多樣性紅色名錄-大型真菌卷》[20]，以及戴玉成[21]、李熠[22]、李增智等[23]、段東娥[24]、MONGKOLSAMRIT 等[25]、武英達等[26]、劉順等[27]、李海蛟等[28]、郭婷等[29]所發表的相關文獻進行確定。食用菌、藥用菌、有毒蘑菇的確定參考戴玉成等[30-31]、圖力古爾等[32]、李海蛟等[33]發表的相關文獻。

1.5 統計分析

使用WPS 表格軟件，對分類數據進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 有效分離菌株的分類統計結果

對2010 年至2021 年分離保藏的297 株可培養大型真菌菌株進行分離鑒定，共獲得246 株有效分離菌株、占總數的82.8%；51 株無效分離菌株，占總數的17.2%。進一步對有效分離菌株進行分類統計，結果詳見表1。

表1 有效分離菌株分類單元統計Tab.1 The total taxa of effective isolates

如表1 所示，246 株有效分離菌株隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 和子囊菌門（Ascomycota） 的5 綱12 目34 科70 屬115 種。其中屬于蘑菇綱（Agaricomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes） 的種類最多，分別有94 種（81.7%）、17 種（14.8%）。其余菌株屬于花耳綱（Dacrymycetes）、盤菌綱（Pezizomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）。在目一級水平上，屬于蘑菇目（Agaricales） 的菌株種類最多，有45 種，占總數的39.1%；屬于多孔菌目（Polyporales） 的有36 個種，占總數的31.3%；屬于肉座菌目（Hypocreales） 的有16 個種，占總數的13.9%。屬于其他目的菌株種類占比較少，屬于木耳目（Auriculariales） 的有3 個種、屬于銹革菌目（Hymenochaetales） 的有3 個種、屬于牛肝菌目（Boletales） 的有2 個種，屬于花耳目（Dacrymycetales）、炭角菌目（Xylariales）、盤菌目（Pezizales）、格孢菌目（Pleosporales） 的則均僅有1 個種。

在科一級水平上對菌株進行統計，結果詳見表2 （僅列出含有5 個種以上的科）。

表2 主要科的物種數量統計Tab.2 The dominant fungal families

如表2 所示，在科一級水平上，屬于蘑菇科（Agaricaceae） 的有16 個種，占總數的13.9%；屬于多孔菌科（Polyporaceae） 的有15 個種，占總數的13.0%；屬于球蓋菇科（Strophariaceae） 的有12 個種，占總數的10.4%；屬于蟲草科（Cordycipitaceae）的有10 個種，占總數的8.7%；屬于擬層菌科（Fomitopsidaceae） 的有8 個種，占總數的7.0%；屬于靈芝科（Ganodermataceae） 的有5 個種，占總數的4.3%；屬于其它科的種數均在5 種以下。

在屬一級水平上對菌株進行統計，結果詳見表3 （僅列出含有5 個種以上的屬）。

表3 主要屬的物種數量統計Tab.3 The dominant fungal genera

如表3 所示，在屬一級水平上，屬于蟲草屬（Cordyceps） 的有8 個種，屬于擬層孔菌屬（Fomitopsis） 的有6 個種，屬于栓孔菌屬（Trametes） 的有5 個種，屬于靈芝屬（Ganoderma） 的有5 個種，屬于蘑菇屬（Agaricus） 的有5 個種。屬于其它屬的菌株占比較低，各屬包含物種數均少于5 種。

2.2 食用菌資源評價結果

將麗水白云山、南明山等地分離的115 種246株有效分離菌株按食用價值進行分類，可分為食用菌、藥用菌、有毒蘑菇和食毒不明蘑菇4 類。其中食用菌有23 種，占總種數的20.0%；藥用菌有24種，占總種數的20.1%；有毒蘑菇有15 種，占總種數的13.0%；食毒不明的其它大型真菌資源61 種，占總種數的53.0%。

23 個記載可以食用的種類信息詳見表4，部分子實體形態特征詳見圖1。

圖1 部分食用菌子實體Fig.1 Fruit bodis of some of the collected edible fungi

表4 食用大型真菌種類Tab.4 Edible macrofungi species

如表4 和圖1 所示，在23 種食用菌中，有13種可大規模人工栽培，分別為皺木耳、毛木耳、毛頭鬼傘、牛舌菌、金針菇、卵孢小奧德蘑、花臉香蘑、白鬼筆、多脂鱗傘、白黃側耳、糙皮側耳、肺形側耳、裂褶菌。褐黃木耳與毛木耳2 個種類的有效分離菌株均有6 個，在所有食用菌中，菌株分離數量最多。

2.3 藥用菌資源評價

分析發現，有效分離菌株中共有藥用菌種類24種，詳細信息見表5，部分子實體形態特征見圖2。

圖2 部分藥用菌子實體Fig.2 Fruit bodies of some of the collected medicinal fungi

如表5 和圖2 所示的藥用菌中，有13 種被報道可進行人工栽培，分別是粉蟲草、高雄山蟲草、細腳蟲草、紅貝俄氏孔菌、紅緣擬層孔菌、樹舌靈芝、南方靈芝、有柄靈芝、靈芝、白囊耙齒菌、蟬棒束孢、網紋馬勃、云芝栓孔菌。

2.4 有毒蘑菇資源評價

所有有效分離菌株中，共有有毒蘑菇7 種，中毒類型有神經精神型和腸胃炎型2 種，詳細信息見表6，子實體形態特征見圖3。

圖3 有毒蘑菇子實體Fig.3 Fruit bodies of poisonous fungi

表6 有毒蘑菇種類Tab.6 Poisonous fungi species

如表6 和圖3 所示的有毒蘑菇中，可造成神經精神型中毒的種類有：白黃小脆柄菇、糞生光蓋傘、熱帶紫褐裸傘、蘇梅島裸蓋菇?？稍斐赡c胃炎型中毒的種類有：大青褶傘、叢生垂幕菇、磚紅垂暮菇。白黃小脆柄菇在所有有毒蘑菇中分離到的菌株最多，在蓮都白云山、蓮都南明山兩地共分離到7 株。

3 討論

根據利用價值，大型真菌資源可分為食用菌、藥用菌、有毒蘑菇3 類。據統計，我國有食用菌近1 000 種，可實現商業化栽培的約有60 種[2]；藥用真菌473 種，也僅有80 余種實現了人工栽培[30]。從數量來看，我國仍有大量的大型真菌資源可被開發利用。本試驗中共獲得可人工栽培的食用菌13 種，46個菌株，其中皺木耳、毛木耳、毛頭鬼、牛舌菌、白鬼筆、多脂鱗傘、白黃側耳、裂褶菌等種類在麗水市還未見較大規模栽培，可作為麗水食用菌產業未來發展的備選種類。在藥用菌方面，試驗獲得藥用菌24 種，102 個菌株，其中靈芝、樹舌靈、南方靈芝、有柄靈芝、紅緣擬層孔菌等種類可為藥用菌產業提供新的資源，擴大本地以靈芝為代表的藥用菌產業范圍。對這些種類進行開發利用，可為本地的食（藥） 用菌產業發展提供新的動力。近年，高雄山蟲草與細腳蟲草被修訂為一個種——Cordyceps tenuipes，因對新分類系統的接納有滯后性，此次仍以原數據庫比對結果為依據進行分類，這也從側面說明對其研究尚不充分[34]。

蘑菇中毒是我國最嚴重的食品安全問題之一，僅2022 年就發生蘑菇中毒事件482 次，1 332 人中毒，28 人死亡[35]。因此對毒蘑菇的種類、有毒成分、中毒類型等進行研究，有助于預防中毒事件，提高中毒治療效果。試驗分離到7 種有毒蘑菇，共15 個菌株，其中白黃小脆柄菇、糞生光蓋傘、熱帶紫褐裸傘、蘇梅島裸蓋菇可造成神經精神型中毒，大青褶傘、叢生垂幕菇、磚紅垂暮菇可造成腸胃炎型中毒。但目前國內對這些有毒蘑菇研究多集中于資源調查，僅有少量與毒素相關的研究，如何對其進行開發利用還有待深入研究。

試驗除對有效分離菌株進行分類鑒定外，還對51 株無效分離菌株進行了鑒定。多數無效分離菌株可根據分子鑒定結果及其菌落形態進行辨別，為以后野生大型真菌分離提供一定參考。但有些種類的真菌因菌落形態與多數大型真菌相近，出現分離錯誤也較難在早期發現。如小包擬盤多毛孢[Pestalotiopsis microspora （Speg.） G.C.Zhao & Nan Li] 的菌落白色濃密，生長速度中等[36]，菌落生長早期與其它大型真菌較難區分，易導致錯誤分離，但其生長后期有大量黑色液滴狀分生孢子產生，可依據此特征進行辨別。又如白囊耙齒菌[Irpex lacteus （Fr.）Fr.]，其本身為一種常見的木腐真菌，菌落白色較薄，呈輕微升起的棉花絮狀，生長速度較快[37]，以上特征與多數大型真菌類似，且具有分生節孢子，容易擴散引起污染，僅憑形態特征較容易導致分離錯誤，需要結合分子生物學數據、出菇性狀等進行區分。