基于JNK信號通路探討自噬、胰島素抵抗在非酒精性脂肪性肝病中的發病機制

延 華,柴春艷,張 丹,趙 媛,李 敏

(1.陜西省人民醫院老年病院,陜西 西安 710068;2.陜西省人民醫院保健辦,陜西 西安 710068)

隨著肥胖的流行和生活方式的改變,全球非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為第一大慢性肝病的病因。NAFLD不僅可以導致肝纖維化、肝硬化,還與肥胖、2型糖尿病、血脂異常等一起作為代謝綜合征的組分互為因果、相互影響[1]。所有這些代謝紊亂又均與胰島素抵抗(InsuIin resistance,IR)相關[2]。由于IR,胰島素升高通過與胰島素受體結合,并通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)激活下游信號通路,從而刺激血糖攝取和儲存[3]。C-Jun N末端激酶(JNK)與IR密切相關,并由炎癥細胞因子和游離脂肪酸(FFA)激活[3]。研究[4]表明,JNK的激活會加速脂質積累并導致肝臟損傷。自噬是一個至關重要的生理過程,通過調節細胞內脂質儲存,消除受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質,在細胞穩態中發揮重要作用[5]。研究[6]報道,自噬與NAFLD發病機制有關,自噬功能障礙已在NAFLD患者、NAFLD小鼠模型肝臟中被檢測到。JNK信號通路對自噬過程至關重要,JNK的激活有助于自噬基因Beclin-1的表達,介導異常的自噬調節和介導p53磷酸化[7]。自噬異常干擾脂質代謝,自噬功能異常可能促進NAFLD發病。JNK、胰島素抵抗、自噬均與NAFLD的病理過程有關。然而,它們之間的關系還沒有被完全闡明。因此,了解JNK信號通路介導脂質代謝的分子機制,對于尋求NAFLD新的治療方法具有重要意義。本文以NAFLD大鼠模型研究JNK信號通路在胰島素抵抗和自噬中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只,8周齡,180～200 g,來自西安交通大學動物中心。大鼠在標準條件下飼養:溫度25 ℃,12 h光/暗循環,以及自由采食標準實驗室飼料和水。

1.2 實驗試劑 SP600125(No.S1460,EMD Millipore,Billerica,美國),ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司),放射免疫沉淀分析裂解緩沖液(No.20101ES60,中國海門生物技術研究所),Lowry蛋白測定試劑盒(No.C504031,Pierce,Thermo Fisher Scientific,Inc,美國),聚偏二氟乙烯膜上(No.DVPP00010,EMD Millipore,Bedford,MA,美國)。Anti-Akt(No.2920)、磷酸化(p)Akt(Ser473)(No.4060)、anti-Atg 3(No.3415)、anti-Atg 5(No.12994)、anti-LC-3(No.4108)、anti-Beclin 1(No.3783)(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA,美國),anti-IRS1(No.05-784)、 anti-p-IRS1(Ser307)(No.05-1087)(均為EMD Millipore),抗IRβ (No.sc-711)、anti-p-IRβ(Tyr 1150/1151)(No.sc-81500)、anti-p-JNK1 (Thr183)(No.sc-135642)、anti-JNK1(No.sc-571)和抗GAPDH(No.sc-20357,Santa Cruz,美國)。磷酸緩沖鹽溶液(PBS,No.P1002北京索萊寶生物科技公司)。辣根過氧化物酶偶聯的二抗(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Inc,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物模型制備:將大鼠隨機分為四組,正常飲食組(ND組,n=10)、高脂飲食組(HFD組,n=10)、JNK抑制劑SP600125治療組(SP60012520組,n=10)、磷酸鹽緩沖鹽水PBS對照組(Control組,n=10)。ND組喂食正常飼料,HFD組、SP600125組和Control組喂食高脂飼料(88%基礎飼料+2%膽固醇+10%豬油組成)20周,SP600125組大鼠腹腔注射SP600125(30 mg/kg體重)、Control組大鼠注射磷酸鹽緩沖鹽水PBS,每天1次,再延長8周。20周結束時,ND組和HFD組用戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg/kg體重,腹腔內注射),經頸椎脫位處死后進行生化分析,對大鼠的肌肉、脂肪和肝臟標本進行Western blot檢測。SP600125組和Control組治療后,大鼠頸椎脫位處死,進行生化分析,并對大鼠肝臟標本進行Western blot檢測。

1.3.2 生化分析:使用ELISA試劑盒檢測血清FFA和胰島素水平。糖耐量測試在喂食ND或HFD 20周后進行,禁食6 h后,ND組和HFD組大鼠腹腔注射葡萄糖(2.0 g/kg體重)。在不同時間點(0、15、30、60、120 min)尾靜脈采血,使用便攜式血糖儀[型號 860,江蘇魚躍醫療器材有限公司(南京)]檢測血糖水平。

1.3.3 胰島素抵抗測定:為了評估高脂飲食喂養的大鼠肝臟是否出現胰島素抵抗,將大鼠禁食過夜,并腹腔注射胰島素(1.5 U/kg)。30 min后,分離肝臟并進行Western blot檢測磷酸化胰島素受體β亞基(p-IRβ)和磷酸化胰島素受體底物-1(p-IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)。

1.3.4 Western blot檢測目的蛋白表達:使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液從組織中分離蛋白。將勻漿在15000 r/min、4 ℃下離心30 min,丟棄顆粒。蛋白濃度用Lowry蛋白測定試劑盒,用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離20 g蛋白,樣品裝在聚丙烯酰胺凝膠上。隨后,凝膠中的蛋白質被印跡到聚偏二氟乙烯膜上。用含0.1% Tween-20的5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h,然后在4 ℃下用一級抗體探針過夜。使用的主要抗體如下:Anti-Akt(1∶1000),磷酸化(p)Akt(Ser473)(1∶1000),anti-Atg 3(1∶1000),anti-Atg 5(1∶1000),抗LC-3(1∶100),anti-Beclin 1,anti-IRS1(1∶2000), anti-p-IRS1(Ser307)(1∶2000),抗IRβ(1∶500),anti-p-IRβ(Tyr 1150/1151)(1∶500),anti-p-JNK1 (Thr183)(1∶200),anti-JNK1(1∶400)和抗GAPDH(1∶10 000)。然后將印跡與相應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下放置1 h。使用增強的化學發光檢測系統(EMD Millipore)對印跡進行可視化,并將印跡暴露于薄膜中。使用Image 2.0版本(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,美國)進行量化。

1.4 統計學方法 所有數據分析使用SPSS 17.0統計學軟件進行,計量資料以平均值±標準差表示,采用t檢驗進行分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ND組與HFD組大鼠血糖、游離脂肪酸及胰島素水平比較 腹腔注射葡萄糖后,ND組大鼠血糖濃度略有升高,但在120 min時降至空腹水平。HFD組大鼠血糖濃度逐漸升高,在60 min時達到峰值,到120 min尚未恢復正常水平,見表1。與ND組大鼠相比,HFD組大鼠血清中FFA和胰島素水平顯著升高(P<0.05),見表2。

表1 ND組與HFD組大鼠不同時間血糖水平比較(mmol/L)

表2 ND組與HFD組大游離脂肪酸及胰島素水平比較

2.2 ND組與HFD組大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中p-JNK1蛋白表達水平比較 檢測大鼠肌肉、脂肪和肝臟中p-JNK1蛋白的表達水平,結果顯示,與ND組相比,HFD組的大鼠的p-JNK1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見圖1。

注:*P<0.05,**P<0.01圖1 ND組與HFD組大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中p-JNK1蛋白表達水平比較

2.3 ND組與HFD組大鼠肝臟自噬相關蛋白表達水平比較 與ND組相比,HFD組自噬相關蛋白LC-3Ⅱ、Beclin-1、Atg 5和Atg 3表達水平上調(均P<0.05),見圖2。

注:*P<0.05,**P<0.01圖2 ND組與HFD組大鼠肝臟自噬相關蛋白表達水平比較

2.4 ND組與HFD組大鼠胰島素抵抗指標p-IRβ、p-IRS-1、p-Akt表達水平比較 與ND組相比,HFD組大鼠的p-IRβ、p-IRS-1和p-Akt表達水平升高,差異具有統計學意義(均P<0.05),見圖3。

注:*P<0.05,**P<0.01圖3 ND組與HFD組大鼠胰島素抵抗指標p-IRβ、p-IRS-1、p-Akt表達水平比較

2.5 SP600125組和Control組大鼠p-JNK1和自噬相關蛋白、胰島素抵抗指標比較 與Control組對比,SP600125組p-JNK1水平下降,SP600125組大鼠肝臟中自噬相關蛋白LC-3Ⅱ、Beclin-1、Atg 5、Atg 3以及p-IRβ、p-IRS-1和p-Akt蛋白表達水平顯著降低,差異具有統計學意義(均P<0.01),見圖4。

注:**P<0.01,***P<0.001圖4 SP600125組和Control組大鼠p-JNK1(A)和自噬相關蛋白(B)、胰島素抵抗指標(C)比較

2.6 SP600125組和Control組大鼠FFA和胰島素水平比較 與Control組相比,高脂飲食喂養的SP600125組大鼠血清中FFA和胰島素水平顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 SP600125組和Control組大鼠FFA和胰島素水平比較

3 討 論

NAFLD是最常見的慢性肝病,與腹型肥胖、血脂異常、胰島素抵抗等代謝危險因素密切相關[8-9]。近年來,NAFLD的發病率呈上升趨勢,但發病年齡呈下降趨勢[8]。然而,NAFLD的確切發病機制仍未完全闡明,目前也沒有明確的藥物途徑來調節肝臟脂肪變性,降低胰島素抵抗,改善脂肪肝[10]。

由于胰島素抵抗,胰島素升高通過與胰島素受體結合,促進IRβ亞基(IRβ)和IR底物-1 (IRS-1)的磷酸化,并通過PI3K-Akt激活下游信號通路,從而調節血糖攝取和儲存[3]。C-Jun N末端激酶(JNK包括JNK1、JNK2和JNK3亞型)與胰島素抵抗相關,研究認為JNK1、JNK2在高脂飲食喂養小鼠中介導胰島素抵抗,JNK可被炎性細胞因子和FFA激活,激活的JNK會使其下游的靶點IRS-1的絲氨酸307位點磷酸化,從而減弱胰島素敏感性[11]。研究[12]顯示,JNK激活能夠上調細胞中自噬相關基因Beclin-1和微管相關蛋白1A/1B輕鏈3 (LC-3)Ⅱ的表達水平,而SP600125(JNK的抑制劑)或JNK的敲低逆轉了這一過程。

雖然以往的研究已經證實JNK、自噬和胰島素抵抗是相關的[13],但JNK在異常自噬和胰島素抵抗在NAFLD發病機制中的作用尚未闡明。本研究假設JNK信號通路可能是HFD誘導的胰島素抵抗及自噬功能的關鍵調節因子。研究[14]表明,胰島素抵抗與NAFLD的病理進展密切相關,而JNK是胰島素信號通路中的關鍵分子。研究[15]表明,TNF-α、FFA和活性氧激活JNK,從而促進胰島素抵抗的發生和進展。在本研究中,在高脂飲食喂養的肥胖大鼠中,JNK活性在胰島素敏感組織(如肝臟和脂肪)中顯著增加。激活的JNK使IRS-1的絲氨酸殘基磷酸化,從而導致胰島素抵抗。此外, JNK1已經被報道作為一個關鍵的分子連接肥胖、炎癥和葡萄糖穩態紊亂[16]。Ozcan等[17]報道肥胖誘導的內質網應激可能通過JNK的過度激活導致胰島素受體信號通路的抑制。越來越多的證據表明JNK可能被認為是治療胰島素抵抗和糖尿病的一個潛在的治療靶點[18]。因此,闡明JNK引發胰島素抵抗并導致NAFLD的確切機制非常必要。為了探討這種復雜的發病機制,本研究測定了喂食ND或HFD的大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中的JNK活性,結果顯示JNK在HFD大鼠中被激活。

此外,Western blot分析表明,高脂飲食誘導大鼠肝臟發生自噬、IRS-1和Akt的磷酸化。自噬功能障礙可能導致肝臟內脂質過度積累,從而促進NAFLD的發生和進展。自噬相關基因表達、自噬小體的蛋白水平在肥胖脂肪組織和胰島素抵抗中被證明顯著增加[19]。本研究表明,在HFD喂養的大鼠中,IRS-1的絲氨酸307位點被過度磷酸化,同時p-Akt (Ser473)增加。此外,在高脂飲食大鼠肝臟中觀察到激活的自噬相關基因LC-3 Ⅱ、Beclin-1、Atg 5、Atg 3高表達。可以推測,JNK介導的自噬通路在胰島素抵抗中具有重要作用。這些結果可能為NAFLD的潛在治療提供一定依據。

JNK可以調節細胞的自噬,以應對各種應激。Shimizu等[7]證明了滅活的JNK可以抑制自噬細胞死亡。此外,有研究[20]發現抑制JNK顯著抑制了H-ras介導的Atg 5誘導、自噬和細胞死亡。本研究結果表明,SP600125對JNK有抑制作用,降低了高脂飲食大鼠肝臟的自噬相關基因的表達,并降低了胰島素及游離脂肪酸水平,預防了胰島素抵抗。但SP600125抑制HFD喂養大鼠肝臟自噬和改善胰島素抵抗的分子機制尚不清楚。

總之,本研究證明JNK介導的自噬與胰島素抵抗有關,但還需要進一步的實驗來探索p-JNK干擾自噬相關基因表達并導致胰島素抵抗的分子機制。本研究也表明肥胖與JNK1活性異常升高密切相關,選擇性下調JNK活性為治療人類肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和NAFLD提供了一個有力的依據。JNK可能被認為是預防和治療NAFLD的潛在藥物靶點。