Sirtuins 蛋白在雙酚A 誘導的雄性生殖系統(tǒng)損傷模型小鼠睪丸組織和GC-2 細胞中的表達及其意義

符 璐, 葉嚴玨, 李江英, 湯子怡, 尹 俐

（重慶理工大學藥學與生物工程學院生物制藥系，重慶 400054）

雙酚A（bisphenol A，BPA）在工業(yè)上被用來合成聚碳酸酯（polycarbonate，PC）和環(huán)氧樹脂等材料，被廣泛用于制造食品飲料包裝及醫(yī)療器械等日常用品。作為人類接觸范圍最廣的化學品之一，約90%以上人群的尿液中有BPA 存在［1］。流行病學研究和實驗研究結果［2-3］顯示：BPA 暴露對雄性生物生殖系統(tǒng)有不良影響，如精子形態(tài)異常、精子數(shù)量減少、精子活力降低和生精異常等。因此，探討B(tài)PA 致雄性生殖毒性的相關機制對防治BPA 致雄性生殖系統(tǒng)損傷有重要意義。Sirtuins（Sirt）蛋白家族包含Sirt1～Sirt7 共7 個成員，是一組煙酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD ）依賴性的組蛋白去乙酰化酶。Sirt 家族成員通過作用于各種蛋白質的翻譯后修飾而直接或間接參與糖脂代謝、氧化應激、DNA 修復和炎性反應等病理生理過程［4-6］。其中，Sirt1 參與雄性生殖器官發(fā)育、精子形成和精子質量的調控過程［7］。Sirt3 與異常的精子形態(tài)和精子運動能力有關［8-9］。然而，有關Sirt1～Sirt7 對BPA 致雄性生殖毒性中的研究目前國內外尚未見相關報道。本研究旨在探討 Sirt1～Sirt7 在BPA 誘導的雄性生殖損傷中的作用，為BPA 致雄性生殖毒性的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、主要試劑和儀器40 只SPF級雄性昆明種小鼠，8 周齡，體質量 28～32 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物使用許可證號：SYXK （渝）-2017-0010。動物飼養(yǎng)在22 ℃恒溫動物室中，光照與黑暗間隔周期為12 h，食物和水均可自由獲得。小鼠精母細胞（GC-2 細胞）購自美國ATCC 細胞庫。Sirt1 抗體（產(chǎn)品批號：sc-74465）、Sirt2 抗體（產(chǎn)品批號：sc-28298）、Sirt3 抗體（產(chǎn)品批號：sc-365175）、Sirt4 抗體（產(chǎn)品批號：sc-135797）、Sirt5 抗體（產(chǎn)品批號：sc-271635）、Sirt6 抗體（產(chǎn)品批號：sc-517196） 和Sirt7 抗體（產(chǎn)品批號：sc-365344）購自美國Santa Cruz 公司，β-actin 抗體（貨號66009-1-Ig） 購自美國Proteintech 公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 標記的山羊抗小鼠（貨號A0216）二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，BPA 和玉米油均購自美國Sigma 公司，EdU 試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。計算機輔助精液分析（computer assisted sperm analysis，CASA）系統(tǒng)購自西班牙Microptic 公司，F(xiàn)usion FX 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自法國Vilber 公司，C6 流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.2 實驗動物分組和給藥40 只SPF 級雄性昆明種小鼠隨機分為對照組、低劑量BPA 組（給予3 mg·kg－1·d－1BPA）、中 劑 量BPA 組 （給 予30 mg·kg－1·d－1BPA） 和 高 劑 量BPA 組（給 予300 mg·kg－1·d－1BPA），每組10 只。低、中和高劑量BPA 組小鼠采用玉米油（0.01 mL·g－1）配成相應濃度BPA 灌胃，對照組小鼠給予0.01 mL·g－1玉米油。

1.3 檢測各組小鼠體質量并計算睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)給藥35 d 后稱各組小鼠體質量，處死小鼠，收集睪丸和附睪并分別稱質量。睪丸指數(shù)=睪丸質量/體質量×100%，附睪指數(shù)=附睪質量/體質量×100%。

1.4 CASA 系統(tǒng)分析各組小鼠精子質量小鼠處死后，迅速分離雙側附睪，并用眼科剪剪開附睪尾部后放入37 ℃預熱的輸卵管液中，并采用鑷子晃動促使附睪中的精子游離到輸卵管液中形成精子懸液。采用移液槍吸取10 μL 精子懸液，通過CASA系統(tǒng)分析小鼠精子活力（包括快速前向運動精子百分率、中速前向運動精子百分率、慢速前向運動精子百分率和不動精子百分率）及精子畸形率。

1.5 HE 染色觀察各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)將各組小鼠睪丸組織置于4% 多聚甲醛固定1 周后，經(jīng)過不同濃度乙醇溶液梯度脫水再置入二甲苯中透明后再置入55 ℃石蠟包埋。將包埋好的組織塊用切片機進行切片，60 ℃烘干后保存。根據(jù)HE 染色試劑盒操作流程進行HE 染色，染色結束后加入樹膠采用蓋玻片封片，采用顯微鏡觀察各組小鼠睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.6 各組小鼠GC-2 細胞培養(yǎng)和分組小鼠GC-2細胞采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至對數(shù)生長期進行傳代。傳代后本研究分別采用0、20、40 和80 μmol·L－1BPA 處 理 細 胞，作 用48 h 后收集細胞進行下一步操作。

1.7 EdU 熒光染色法檢測小鼠GC-2 細胞增殖率

取對數(shù)生長期GC-2 細胞，以每孔2.0×105個細胞的密度接種至12 孔細胞培養(yǎng)板中，分為0、20、40 和80 μmol·L－1BPA 組，每組3 個復孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出12 孔細胞培養(yǎng)板，去除細胞培養(yǎng)液，加入500 μL 提 前 配 制 好 的 含50 μmol·L－1EdU 的培養(yǎng)基共孵育2 h。4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100 通透10 min，避光加入100 μL Apollo 染色反應液，最后采用Hoechst 進行細胞核染色。染色完成后，立即在熒光顯微鏡下分析并拍照。其中藍色熒光為Hoechst標記的細胞核，代表所有細胞；紅色熒光為EdU標記的新增殖細胞，隨機選取3 個視野，計數(shù)紅色和藍色熒光標記的細胞數(shù)，計算細胞增殖率。細胞增殖率=紅色熒光標記的細胞個數(shù)/藍色熒光標記的細胞個數(shù)×100%。

1.8 流式細胞術檢測各組小鼠不同細胞周期GC-2細胞百分率采用胰酶消化收集細胞，1 000 g 離心5 min，沉淀細胞，去除上清，加入1 mL PBS 緩沖液重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。加入1 mL 預冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定2 h，1 000 g 離心5 min，沉淀細胞，小心吸除上清，加入1 mL 預冷的PBS 緩沖液，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。每管細胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min。孵育完成后，采用流式細胞術進行檢測。采用Flowjo 軟件分析并擬合細胞周期圖，流式檢測結果圖的第1 個峰代表G0/G1期，第2 個峰較寬，代表S 期，第3 個峰代表G2/M 期。

1.9 流式細胞術檢測各組小鼠GC-2 細胞凋亡率

按上述步驟處理細胞后，采用不含EDTA 的胰 酶 消 化 細 胞，于 室 溫2 000 r·min－1離 心5 min，收集細胞。采用預冷的PBS 緩沖液重懸細胞，2 000 r·min－1離心5 min，棄上清。加入300 μL 1×Binding Buffer 懸浮細胞，再加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混勻后，室溫避光孵育15 min，最后在上機前5 min 再 加 入5 μL PI 染 色，并 補 加200 μL 1×Binding Buffer。染色完成后，采用流式細胞術進行檢測。采用Flowjo 軟件進行分析，繪制散點圖，F(xiàn)ITC 為橫坐標，PI 為縱坐標。左上象限（Q1）為細胞碎片或死亡細胞，左下象限（Q2）為正常活細胞，右上象限（Q3）為晚期凋亡細胞，右下象限（Q4）為早期凋亡細胞。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.10 Western blotting 法檢測各組小鼠睪丸組織和GC-2 細胞中Sirt 家族蛋白表達水平選取各組小鼠睪丸組織和GC-2 細胞加入放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA） 裂解液，采用低溫勻漿機勻漿，4 ℃裂解60 min 后，于4 ℃、12 000 r·min－1離心10 min，吸取上清， 采用BCA法檢測蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，于冰水中電轉至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉液室溫封閉1 h，分別加入Sirt1～Sirt7 和β-actin 抗體，4 ℃ 孵育過夜。采用TBST 洗膜3 次，每次10 min，再加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜后，ECL 顯色，于成像系統(tǒng)上顯影。采用Image J 軟件分析目的蛋白的灰度值，計算目的蛋白表達水平。Sirt1～Sirt7 蛋白表達水平= Sirt1～Sirt7 蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.11 統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠平均體質量、睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、快速前向運動精子百分率、中速前向運動精子百分率、慢速前向運動精子百分率、不動精子百分率、精子畸形率和細胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量、睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)BPA染毒5 周的過程中，各組小鼠行為活動、糞便性狀和外觀體征未見顯著異常。BPA 染毒5 周后，與對照組比較，各劑量BPA 組小鼠體質量和附睪指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），高劑量BPA 組小鼠睪丸指數(shù)降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質量、睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)Tab.1 Body weights,testis indexes,and epididymal indexes of mice in various groups (n=10±s）

表1 各組小鼠體質量、睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)Tab.1 Body weights,testis indexes,and epididymal indexes of mice in various groups (n=10±s）

*P<0.05 vs control group.

Group Control BPA Body weight(m/g)44.55±3.84 Testis index(η/%)0.63±0.11 Epididymal index(η/%)0.08±0.02 Low dose Medium dose Hig dose 0.09±0.01 0.09±0.01 0.08±0.01 46.70±3.40 46.39±4.65 45.85±3.92 0.64±0.07 0.69±0.07 0.55±0.05*

2.2 各組小鼠精子活力和精子畸形率CASA 系統(tǒng)分析結果顯示：與對照組比較，中和高劑量BPA 組小鼠不動精子百分率升高（P<0.01），快速前向運動精子百分率降低（P<0.01），中速前向運動精子百分率降低（P<0.05），高劑量BPA 組小鼠精子畸形率升高（P<0.01）。見表2。

表2 各組小鼠精子活力和精子畸形率Tab.2 Motilities and deformity rates of sperm of mice in various groups (n=10，±s，η/%）

表2 各組小鼠精子活力和精子畸形率Tab.2 Motilities and deformity rates of sperm of mice in various groups (n=10，±s，η/%）

*P<0.05，**P<0.01 vs control group.

Group Control BPA Percentage of rapid progressive sperm 45.48±4.87 Percentage of medium progressive sperm 23.41±2.17 Percentage of nonprogressive sperm 11.67±1.70 Percentage of immobile sperm 19.40±1.85 Deformity rate of sperm 18.00±2.80 Low dose Medium dose High dose 19.80±5.30 23.00±3.70 57.00±17.00**40.08±6.25 28.08±2.44*20.40±2.85**19.43±5.86 15.54±1.93*10.60±3.47*14.56±1.40 15.96±2.38*13.68±1.34 25.93±6.04 40.36±1.97**52.28±6.75**

2.3 各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組小鼠睪丸組織內曲細精管結構正常，生精小管排列整齊，內部生精細胞緊密排列層次分明。各劑量BPA 組小鼠睪丸組織均呈現(xiàn)出不同程度病理異常。低劑量BPA 組小鼠睪丸組織中出現(xiàn)少量曲細精管基底膜處出現(xiàn)空泡，生精細胞減少；中劑量BPA組小鼠曲細精管內各級生精細胞減少排列疏松；高劑量BPA 組小鼠睪丸組織內各級生精細胞顯著減少，部分生精細胞缺失，生精細胞排列疏松紊亂，且管腔中心精子數(shù)目減少。見圖1。

圖1 各組小鼠睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)（HE，Bar= 20 μm）Fig.1 Morphology of testis tissue of mice in various groups (HE，Bar= 20 μm)

2.4 各組小鼠睪丸組織中Sirt 家族蛋白表達水平與對照組比較，低劑量BPA 組小鼠睪丸組織中 Sirt6 蛋白表達水平降低（P<0.01），中劑量BPA 組小鼠睪丸組織中Sirt1、Sirt2 和Sirt6 蛋白表達水平降低（P<0.01），高劑量BPA 組小鼠睪丸組 織 中Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt4、Sirt5、Sirt6 和Sirt7 蛋白表達水平降低（P<0.05 或P<0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠睪丸組織中Sirt1～Sirt7 蛋白表達水平Fig.2 Expression levels of Sirt1－Sirt7 proteins in testis tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠GC-2 細胞增殖率EdU 熒光染色法檢測結果顯示：20、40 和80 μmol·L－1BPA 處理48 h 后，新生細胞數(shù)降低（圖3）。與0 μmol·L－1BPA 組 比 較，20、40 和80 μmol·L－1BPA 組 細 胞增殖率降低（P<0.01）（圖4）。

圖3 各組小鼠GC-2 細胞增殖情況(EdU 熒光染色，×200)Fig.3 Proliferation of GC-2 cells of mice in various groups（EdU fluorescence staining,×200）

圖4 各組小鼠GC-2 細胞增殖率Fig.4 Proliferation rates of GC-2 cells of mice in various groups

2.6 各組小鼠不同細胞周期GC-2 細胞百分率作用24 h 后，與0 μmol·L－1BPA 組 比 較，40 和80 μmol·L－1BPA 組S 期及G2/M 期細胞百分率升高（P<0.01）；處理48 h 后，與0 μmol·L－1BPA組比較，40 和80 μmol·L－1BPA 組G2/M 期細胞百分率升高（P<0.01）。見圖5 和6。

圖5 流式細胞術檢測各組小鼠GC-2 細胞的細胞周期Fig.5 Cell cycles of GC-2 cells of mice in various groups detected by flow cytometry

圖6 各組小鼠不同細胞周期GC-2 細胞百分率Fig.6 Percentages of GC-2 cells at different cell cycles of mice in various groups

2.7 各組小鼠GC-2 細胞凋亡率作用24 h 后，0 μmol·L－1BPA 組GC-2 細胞 凋亡率為（3.65 ±0.78）%，20、40 和80 μmol·L－1BPA 組細胞凋亡率分別為 （3.96±0.29）%、（6.62±0.45）%及（8.96±0.37） % 。 作 用48 h 后， 20、 40 和80 μmol·L－1BPA 組GC-2 細 胞 凋 亡 率 分 別 為（7.71±0.63）%、（11.78±0.46）%及（17.70±0.63）%，均 高 于0 μmol·L－1BPA 組（3.53%±0.81%）（P<0.01）。見圖7。

圖7 流式細胞術檢測各組GC-2 細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of GC-2 cells of mice in various groups detected by flow cytometry

2.8 各組小鼠GC-2 細胞中Sirt 家族蛋白表達水平作 用24 h 后，與0 μmol·L－1BPA 組 比 較，20 μmol·L－1BPA 組小鼠GC-2 細胞中Sirt4 和 Sirt7蛋白 表 達 水 平 降 低 （P<0.05 或P<0.01），80 μmol·L－1BPA 組小鼠GC-2 細胞中Sirt4 和Sirt7蛋白表達水平降低（P<0.05 或P<0.01）。作用48 h 后，與0 μmol·L－1BPA 組比較，20 μmol·L－1BPA 組 小 鼠GC-2 細 胞 中Sirt2、 Sirt3、Sirt4 和Sirt6 蛋白表達水平降低（P<0.05 或P<0.01），40 μmol·L－1BPA 組小鼠GC-2 細胞中Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt4 和Sirt6 蛋白表達水平降低（P<0.05或P<0.01），80 μmol·L－1BPA 組小鼠GC-2 細胞中Sirt1、 Sirt2、Sirt3、Sirt4、Sirt 5 和Sirt6 蛋白表達水平降低（P<0.05 或P<0.01）。見圖8。

圖8 各組小鼠GC-2 細胞中Sirt1～Sirt7 蛋白表達水平Fig.8 Expressions levels of Sirt1-Sirt7 proteins in GC-2 cells of mice in various groups

3 討 論

作為一種廣泛存在于日常用品中的環(huán)境內分泌干擾物， BPA 對雄性生殖系統(tǒng)的毒性（睪丸發(fā)育異常、精子質量降低和各級生精細胞損傷等）在人群及動物研究中得到證實［2，10-12］。本研究結果顯示：染毒5 周，與對照組比較，各劑量BPA 組小鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)降低，精子畸形率升高，不動精子百分率升高，前向運動精子百分率降低，小鼠睪丸組織中曲細精管排列紊亂，各級生精細胞減少。本實驗結果進一步證實了BPA 具有降低精子質量，影響各級生精細胞發(fā)育等雄性生殖毒性。

研究［13-16］顯示：BPA 的生殖毒性與氧化應激、內質網(wǎng)應激、線粒體損傷、DNA 損傷和DNA 甲基化等有密切關聯(lián)，但有關BPA 的生殖毒性作用機制仍有待進一步完善。在哺乳動物中，Sirt 家族包括7 個成員（Sirt1～Sirt7），其均有1 個保守的NAD 結合催化結構域，這對活性至關重要。Sirt 家族在細胞穩(wěn)態(tài)、能量代謝、細胞凋亡和年齡相關疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［17-18］，但其在BPA 致雄性生殖損傷中的作用尚不清楚。

Sirt1 是Sirt 家族中被廣泛研究的成員。Sirt1 缺失的雄性小鼠表現(xiàn)出雄性生殖器官小、各級生精細胞缺失、精子畸形率升高、精母細胞和精子細胞凋亡率增加和精子數(shù)降低且無活力［7］。本研究結果顯示：BPA 染毒小鼠睪丸組織中Sirt1 表達水平降低，睪丸指數(shù)降低，各級生精細胞缺失，精子質量降低，與Sirt1 在雄性生殖系統(tǒng)中的作用一致。小鼠精母細胞GC-2 細胞實驗顯示：BPA 處理后，精母細胞增殖受到抑制，細胞凋亡率升高，表明BPA可能通過下調Sirt1 表達進而影響雄性生殖系統(tǒng)功能。

Sirt3 表達水平與異常的精子形態(tài)和運動性有關［8-9］。WANG 等［19］發(fā)現(xiàn)：鎘暴露會導致大鼠睪丸形態(tài)受損，曲細精管內生殖細胞丟失和空泡化。Sirt3 激活劑可挽救Cd 誘導的睪丸形態(tài)損傷，而Sirt3 抑制劑則加劇鎘的影響。本研究結果顯示：BPA 作用后，小鼠GC-2 細胞中Sirt3 蛋白表達水平降低，提示BPA 染毒造成了小鼠睪丸、各級生精細胞受損和小鼠GC-2 細胞損傷。Sirt3 可能在BPA致雄性生殖毒性中發(fā)揮重要作用。

目 前 關 于Sirt2、Sirt4、Sirt5、Sirt6 和Sirt7 在雄性生殖系統(tǒng)的作用還有待進一步完善［17，20］。研究［21-22］顯示：Sirt2 可能通過對α-微管蛋白乙酰化的調控而影響精子鞭毛微管的活力，但其在男性生育能力中的作用尚未明確。在LPS 處理的睪丸支持細胞中，過表達Sirt4 可抑制B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 和Bcl-2 相 關X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）易位，降低細胞色素c 和含半胱氨酸的天冬氨酸酶3 （apoptosisrelated cysteine peptiduse 3，caspase 3）的表達，從而 提 升LPS 引 起 的 細 胞 活 力 降 低［23］。Sirt5 可 能 在精子發(fā)生過程中發(fā)揮作用［24］。研究［25］顯示：高脂喂養(yǎng)雄性C57BL6 小鼠16 周后，DNA 受損的精子百分率升高，定位在晚期圓形精子細胞向早期細長精子細胞過渡的細胞核中的Sirt6 mRNA 和蛋白表達水平降低。Sirt7 缺失導致DNA 損傷和DNA 復制應激增加，且Sirt7-/-胚胎成活率低［26］，提示Sirt2、Sirt4、Sirt5、Sirt6 和Sirt7 可能在男性生殖中起重要作用，但還需要進一步研究來闡明其作用機制。本研究結果顯示：在BPA 染毒的小鼠動物模 型 和GC-2 細 胞 中Sirt2、Sirt4、Sirt5、Sirt6 及Sirt7 蛋白表達水平均降低，提示Sirt2、Sirt4、Sirt5、Sirt6 和Sirt7 可能是BPA 致雄性生殖毒性的作用靶點。

綜上所述，Sirt1～Sirt7 蛋白表達水平下調可加重BPA 誘導的雄性生殖損傷，提示Sirt1～ Sirt7 可作為BPA 致雄性生殖毒性的防治靶點。但Sirt 家族在BPA 致雄性生殖毒性中作用機制還需進一步研究。