二氧化硫對大鼠急性心肌缺血損傷后心肌纖維化的改善作用及其機制

劉 星, 劉佳麗, 聶連桂, 劉茂軍, 趙俊雄, 汪劉洋, 楊 軍

（南華大學衡陽醫學院附屬第一醫院心內科， 湖南 衡陽 421001）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠心病最嚴重的表現，也是全世界最常見的致死原因之一［1］。盡管溶栓治療和經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI） 血 運 重建等治療手段明顯提高了MI 患者的早期存活率，但發生MI 時，心肌急性缺血損傷導致的病理性心肌重構可導致患者心功能下降，嚴重影響MI 患者的 遠 期 預 后［2］。心 肌 纖 維 化（myocardial fibrosis，MF） 是心肌重構的主要病理表現形式，與MI 后患者的預后不良有密切關聯，然而目前對MF 和心肌重構尚無針對性干預手段。

二氧化硫（sulfur dioxide ，SO2） 是一種新型內源性氣體信號分子，內源性SO2具有多種生物學功能，對心血管系統具有重要作用。SO2可拮抗高血壓、抑制肺動脈高壓、改善動脈粥樣硬化和降低心臟缺血再灌注損傷，其內在機制可能與維持鈣穩態、抑制氧化應激、抗炎、調節自噬和細胞凋亡有關聯［3-4］。WANG 等［5］研究顯示： SO2可以通過抑制內質網應激而改善MI 后MF，但其機制尚未完全闡明。自噬是一種通過溶酶體降解途徑自我吞噬的生理過程，在不同的細胞環境和條件下發揮促生存或促死亡的作用［6］，研究［7］顯示：自噬與MF 和心肌重構具有緊密聯系，但SO2能否通過調控自噬改善急性心肌缺血損傷后MF 尚不清楚。本研究以自噬為切入點，探討外源性SO2對大鼠急性心肌缺血損傷后MF 的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器于南華大學動物實驗中心挑選24 只SPF 級雄性成年SD 大鼠，體質量（250±20）g，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘） 2015-0002，動物使用許可證編號：SYXK（湘）2015-0001，將其飼養于SPF 級實驗室，保持恒溫（22 ℃±2 ℃）和恒濕狀態，人工照明，晝夜交替各12 h，自由攝食攝水。實驗過程嚴格遵守南華大學實驗動物管理辦法。亞硫酸鈉（Na2SO3）和亞硫酸氫鈉（NaHSO3） 均購自美國Sigma 公司，異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）購自大連美倫生物科技有限公司，兔抗大鼠基質金屬蛋白酶8 （matrix metalloproteinase-8，MMP-8）、基質金屬 蛋 白 酶 抑 制 劑 2 （tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （aspartate proteolytic enzyme containing cysteine-9，Caspase-9）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3（aspartate proteolytic enzyme containing cysteine-3，Caspase-3）、自噬相關蛋白3（autophagy related protein 3，Atg3）、自噬相關蛋白5（autophagy related protein 5，Atg5）、自噬相關16 樣蛋白1（autophagy related 16 like protein 1，ATG16L1）、GAPDH 抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標記的山 羊抗兔IgG 二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司，BCA蛋白檢測試劑盒、增強型化學發光試劑盒和 SDSPAGE 凝膠制備試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，Masson 染色試劑盒由上海威奧生物科技有限公司提供， Tunel 試劑盒（KGA704） 由江蘇凱基生物技術有限公司提供。電源、電泳槽和轉膜槽均購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 實驗動物分組和急性心肌缺血損傷動物模型的制備先將所有大鼠適應性喂養1 周，隨后采用隨機數字表法將其隨機分為對照組、ISO 組（給予ISO）、ISO+SO2組（給 予ISO+SO2） 和SO2組（給予SO2），每組6 只。ISO 組和ISO+SO2組大鼠連續2 d 腹腔注射ISO（50 mg·kg－1·d－1）構建急性心肌缺血損傷大鼠模型，對照組和SO2組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，完善心電圖及血漿肌鈣蛋白T水平檢測確定造模成功后，ISO+SO2組和SO2組大鼠腹腔注射SO2供體Na2SO3溶液（0.54 mmol·kg－1·d－1）和NaHSO3溶 液（0.18 mmol·kg－1·d－1）［8］，注射4周，同時對照組和ISO 組大鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.3 各組大鼠心電圖檢查和血漿肌鈣蛋白T 水平檢測麻醉大鼠，麻醉后迅速將其擺為平臥位并固定體位，通過導聯線固定，記錄標準導聯心電圖。隨后立即采集尾靜脈血，采用化學發光免疫分析法檢測各組大鼠血漿超敏肌鈣蛋白T 水平。

1.4 超聲心動圖檢測各組大鼠心功能各組大鼠稱體質量，麻醉大鼠，除去大鼠前胸體毛，固定于檢測臺上，采用M 型超聲檢測左心室運動情況，取心率穩定的3 個心動周期進行測量，檢測各組大鼠左心室短軸縮短率（left ventricular short axis shortening rate，LVFS） 和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 標本采集和處理麻醉大鼠后開胸取出心臟，剪取部分左心室肌組織以4%多聚甲醛固定，剩余大鼠心肌組織－80 ℃保存用于后續實驗。

1.6 Masson 染色觀察各組大鼠心肌組織中膠原沉積情況4%多聚甲醛固定的心室肌組織以梯度乙醇浸泡脫水，石蠟包埋、切片，將石蠟切片脫蠟至水化，以 Masson 試劑盒染色，按照試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件進行纖維化定量分析，計算各組大鼠心肌組織中膠原體積分數（collagen volume fraction，CVF）。CVF=膠原藍染部分面積/總面積×100%。

1.7 TUNEL 染色檢查各組大鼠心肌細胞凋亡率

心肌組織制成石蠟切片后，按照TUNEL 染色試劑盒說明書操作步驟檢測心肌組織細胞凋亡率，熒光顯微鏡下觀察并計算心肌細胞凋亡率。心肌細胞凋亡率=細胞凋亡數/總細胞數×100%。

1.8 Western blotting 法檢測各組大鼠心肌組織中目的蛋白表達水平取保存于－80 ℃的心肌組織，濾紙吸凈水分后剪取0.1 g，加入900 μL 細胞裂解緩沖液、9 μL 苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF），于冰上充分研磨，離心提取上清，采用BCA 法進行蛋白定量，煮沸變性后冷凍保存。制備適當濃度的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠，嚴格按照 Western blotting 實驗步驟進行上樣、電泳、轉膜、封閉，于4 ℃孵育一抗（稀釋比例 1∶1 000）過夜，TBST 洗膜后孵育二抗（稀釋比例1∶ 5 000） 1 h，將 PVDF 膜再次漂洗后均勻涂布顯影液，在顯影儀下顯影，將GAPDH 作為內參，采用Image J 軟件進行灰度值分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統計學分析采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平、LVFS、LVEF、心肌組織中CVF 和心肌細胞凋亡率及心肌細胞中MMP-8、TIMP-2、Caspase-3、Caspase-9、Atg3、Atg5 和Atg16L1 蛋 白 表 達 水 平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心電圖改變和血漿肌鈣蛋白T 水平與對照組比較，ISO 組和ISO+SO2組大鼠心電圖ST 段呈現明顯抬高，且血漿肌鈣蛋白T 水平明顯升高（P<0.05），而SO2組大鼠心電圖及血漿肌鈣蛋白T 水平差異無統計學意義（P>0.05），提示ISO 組和ISO+SO2組大鼠急性心肌缺血損傷模型制備成功。見表1 和圖1。

圖1 各組大鼠心電圖結果Fig.1 Electrocardiogram results of rats in various groups

表1 各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平Tab.1 Levels of troponin T in plasma of rats in various groups [n=6，±s，ρB/（ng·L－1）］

表1 各組大鼠血漿肌鈣蛋白T 水平Tab.1 Levels of troponin T in plasma of rats in various groups [n=6，±s，ρB/（ng·L－1）］

*P<0.05 vs control group.

Group Control ISO ISO+SO2 SO2 Plasma troponin T level 32.86±5.97 307.12±84.06*346.73±27.38*32.65±4.73

2.2 各組大鼠LVFS 和LVEF與對照組比較，ISO 組大鼠LVFS 和LVEF 明顯降低（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠LVFS 和LVEF明顯升高（P<0.05），提示SO2可以改善大鼠急性心肌缺血損傷后的心功能。見表2 和圖2。

圖2 各組大鼠超聲心動圖結果Fig.2 Echocardiogram results of rats in various groups

表2 各組大鼠LVFS 和LVEFTab.2 LVFS and LVEF of rats in various groups(n=6，±s，η/%）

表2 各組大鼠LVFS 和LVEFTab.2 LVFS and LVEF of rats in various groups(n=6，±s，η/%）

*P<0.05 vs control group； △P<0.05 vs ISO group.

Group Control ISO ISO+SO2 SO2 LVEF 72.80±3.27 56.09±10.79*65.41±5.24△71.59±7.67 LVFS 42.26±3.20 29.86±7.33*36.17±4.19△41.45±6.85

2.3 各組大鼠心肌組織中膠原沉積情況與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中CVF 明顯升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中CVF 明顯降低（P<0.05），見圖3 和4。

圖3 各組大鼠心肌組織纖維化情況（Masson 染色，×400）Fig.3 Fibrosis of myocardium tissue of rats in various groups （Masson staining，×400）

圖4 各組大鼠心肌組織中CVFFig.4 CVF in myocardium tissue of rats in various groups

2.4 各組大鼠心肌組織中MMP-8 和TIMP-2 蛋白表達水平與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達水平升高（P<0.05），TIMP-2蛋白表達水平降低（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達水平降低（P<0.05），TIMP-2 蛋白表達水平升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中MMP-8 和TIMP-2 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.5 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of MMP-8 and TIMP-2 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各組大鼠心肌細胞凋亡率與對照組比較，ISO 組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。見圖6 和7。

圖6 各組大鼠心肌細胞凋亡情況 （TUNEL 染色，Bar=50 μm)Fig.6 Apoptosis of cardiomyocyte of rats in various groups（TUNEL staining，Bar=50 μm)

圖7 各組大鼠心肌細胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of cardiomyocytes of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白Caspase-3和Caspase-9 表達水平與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖8。

圖8 各組大鼠心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of Caspase-3 and Caspase-9 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

2.7 各組大鼠心肌組織中自噬相關蛋白Atg3、Atg5 和Atg16L1 表達水平與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中 Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達水平升高（P<0.05）；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達水平降低（P<0.05）。見圖9。

圖9 各組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和 Atg16L1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.9 Eletropohregram(A) and histogram(B) of expressions of Atg3, Atg5， and Atg16L1 proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討 論

近年來 MI 患者的早期生存率提高較多，但心肌的急性缺血性損傷多引起嚴重心肌負性重構導致患者遠期預后不良［9］。作為MI 后心肌重構的主要病理表現，MF 也是導致心室順應性下降、心力衰竭和引起各種類型的心律失常的主要原因，而拮抗心肌缺血損傷后MF 可能是改善MI 患者長期預后的關鍵策略。SO2是一種無色但具有刺激性氣味的有毒氣體，近年來研究［3-4］顯示：SO2在哺乳動物體內可由含硫氨基酸代謝途徑內源性產生，并發現其對心血管系統疾病具有多種調節功能。ZHAO 等［10］研 究 顯 示：SO2可 以 調 節 自 噬 改 善 糖尿病大鼠MF，但SO2能否通過調控細胞自噬和凋亡拮抗急性心肌缺血損傷后MF 目前尚不清楚。

注射大劑量ISO 誘發急性心肌缺血壞死是一種常用的心肌缺血動物模型構建方法，有研究［11］顯示：該方法在實驗動物心臟組織中所引起的病理生理學和形態學改變與人類MI 中觀察到的變化較為相似。本研究以腹腔注射大劑量ISO 構建急性心肌缺血損傷大鼠模型［12］，并檢測大鼠心電圖和血漿肌鈣蛋白水平的變化。本研究結果顯示：與對照組比較，腹腔注射大劑量 ISO 后，ISO 組和ISO+SO2組大鼠心電圖ST 段明顯抬高，血漿肌鈣蛋白 T 水平升高，提示急性心肌缺血損傷大鼠模型構建成功。在給予內源性SO2連續干預4 周后， ISO 組大鼠心功能較對照組明顯降低， ISO+SO2組大鼠心功能較ISO 組明顯改善，提示SO2可以改善急性心肌缺血損傷后大鼠的心功能。

MF 主要由心肌細胞丟失、心肌成纖維細胞增殖活化和心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積過度所誘發［13］，其中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitors metalloproteinases，TIMPs） 相互影響，對 ECM 的穩定進行動態調控，而心肌成纖維細胞活化在釋放大量ECM 蛋白的同時還分泌MMPs，對ECM 進行分解和重塑促進纖維化的發生［14］。有研究［15-16］顯示：纖維化的發展與MMPs 上調和TIMPs 下調有密切關聯，含有TIMP-2 的外泌體可以抑制心肌成纖維細胞的增殖和活化。其中MMP-8 主要由中性粒細胞和巨噬細胞產生，可以有效地降解Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型膠原蛋白及蛋白聚糖和纖連蛋白等［17］，TIMP-2 能抑制多 數MMPs 的 活 性［18］。本 研 究 結 果 顯 示：ISO 組大鼠發生明顯的MF，而SO2組大鼠MF 情況得到了改善。與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達水平升高、TIMP-2 蛋白表達水平降低；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌組織中MMP-8 蛋白表達水平降低、TIMP-2 蛋白表達水平升高，提示SO2可以減輕ISO 誘導的急性心肌缺血損傷后的MF，且其機制可能與調節MMPs/TIMPs 比值有關。

研究［19］顯示：細胞凋亡是MI 期間導致心肌細胞死亡的主要過程。心肌細胞的過度凋亡可導致心肌細胞數急劇下降，并刺激心肌成纖維細胞增殖活化、促進ECM 沉積，誘發MF；相反，有效抑制心肌細胞凋亡可以改善MF［20］。Caspase 家族在細胞凋亡中起重要作用［21］，在缺血缺氧等促凋亡刺激下，心肌細胞中的Caspase 家族級聯通路被激活，從而誘導細胞凋亡的發生。本研究結果顯示：與對照組比較，ISO 組大鼠心肌細胞凋亡率升高、心肌組織中Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平升高；與ISO 組比較，ISO+SO2組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低，且Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達水平降低，提示SO2改善急性心肌缺血損傷后MF可能與減少心肌細胞凋亡有關。

自噬是降解細胞質成分和功能失調的細胞器的重要過程，在正常生理條件下，自噬在維持心肌細胞功能和存活方面起重要作用。然而，過度的自噬可導致功能性細胞器和重要蛋白質降解，進而誘發細胞凋亡［22］。有研究［23］顯示：嚴重的缺血缺氧等損傷應激可導致心肌細胞過度自噬，進而誘發細胞凋亡和心臟功能障礙。REN 等［24］研究顯示：抑制過度自噬可以預防大鼠MI 后心功能不全和MF。本研究結果顯示：與對照組比較，ISO 組大鼠心肌組織中Atg3、Atg5 和Atg16L1 蛋白表達水平升高，提示存在過度激活的細胞自噬；與ISO 組比較，ISO+SO2組 大 鼠 心 肌 組 織 中Atg3、 Atg5 和Atg16L1 蛋白表達水平明顯降低，表明SO2可拮抗急性心肌缺血損傷大鼠心肌組織中的過度自噬，而SO2可能通過抑制過度自噬拮抗細胞凋亡而改善MI 后的MF。

綜上所述， SO2干預后急性心肌缺血損傷大鼠MF 得到明顯改善，同時心肌細胞凋亡明顯減少，細胞自噬水平明顯降低，表明SO2可以改善急性心肌缺血損傷后MF，其機制可能與抑制過度自噬并減少心肌細胞凋亡有關，而調控SO2氣體微環境可能成為拮抗急性心肌缺血損傷后MF 的新思路和新策略。