脂多糖對(duì)小鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中炎癥因子水平的影響及其機(jī)制

胡志寬, 何思琦, 蔣維杰, 趙貴芳, 張 佳, 齊 玲

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；2.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院消化病研究所，廣東 清遠(yuǎn) 511518；3.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床研究中心，湖南 衡陽 675299）

視網(wǎng)膜退行性病變是一種以視網(wǎng)膜神經(jīng)元繼發(fā)性死亡為特征的致盲性眼病，包括視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼等。與其他神經(jīng)退行性疾病相似，視網(wǎng)膜退行性病變神經(jīng)元的繼發(fā)性死亡與神經(jīng)炎癥高度相關(guān)［1］，表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性形態(tài)改變和功能異常，如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化［2］，且激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠損傷或殺死神經(jīng)元［3］，提示抑制神經(jīng)炎癥可能是治療神經(jīng)退行性疾病的切入點(diǎn)。細(xì)胞之間的相互作用是生物體內(nèi)細(xì)胞活動(dòng)的常見形式，作為視網(wǎng)膜固有膠質(zhì)細(xì)胞，Müller 細(xì)胞在應(yīng)對(duì)視網(wǎng)膜損傷時(shí)可作為細(xì)胞因子和炎癥因子的重要來源［4］，應(yīng)激的 Müller 細(xì)胞功能障礙通常會(huì)導(dǎo)致光感受器退化［5］，但是關(guān)于Müller 細(xì) 胞 對(duì) 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）炎癥反應(yīng)的報(bào)道較少。Müller 細(xì)胞可與小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生相互作用，但關(guān)于相互作用后膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)變化的相關(guān)報(bào)道也較少。本研究觀察LPS 誘導(dǎo)Müller細(xì)胞和Müller 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的炎癥反應(yīng)，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞QMMuC-1 和小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 均購自上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司。高糖DMEM 培養(yǎng)基（美國Corning 公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（武漢塞維爾公司），0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone 公司），4% 多聚甲醛（重慶Biosharp 公司）。1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（上海Vetec 公司），谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）抗體（美國Sigmaaldrich 公司），GFAP 和離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1， Iba-1）抗體（美國Abcam 公司），山羊抗鼠IgG 抗體（美國Cell signaling 公司），山羊抗兔IgG 抗體（美國Invitrogen 公司），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（上海吉至生化科技有限公司），TRIzol（上海Ambion 公司）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6 （interleukin-6，IL-6） 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（廣 州GeneCopoeia 公司）。10 cm 培養(yǎng)皿（美國Corning公司），培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），倒置顯微鏡（型號(hào)：徠卡dm2700P，德國徠卡公司），離心機(jī)（型號(hào)：sigma 1-16K，德國Sigma 公司），熒光定量PCR 儀（型號(hào)：伯樂CFX-CONNEC，美國伯樂公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組待細(xì)胞鋪滿10 cm 培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS 緩沖液漂洗2 次，加入適量0.25%胰蛋白酶消化液，培養(yǎng)箱中靜置2～3 min，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙擴(kuò)大、細(xì)胞回縮、細(xì)胞體變圓時(shí)，棄去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化。而后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，1 000 r·min－1離心3 min 后，加入2～3 mL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，吸管反復(fù)輕輕吹打成細(xì)胞懸液，以1∶3 比例，分為3 個(gè)培養(yǎng)皿接種。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入6～8 mL 培養(yǎng)液，置于5% CO 、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組（QMMuC-1 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，采用PBS 緩沖液處理）、共培養(yǎng)對(duì)照組（QMMuC-1細(xì)胞和BV2 細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞比例為1∶1，采用PBS 緩沖液處理）、單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組（QMMuC-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，采用10 mg·L－1LPS 處理）和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組（QMM uC-1 細(xì)胞和BV2 細(xì)胞共培養(yǎng)，采用10 mg·L－1LPS 處理），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 免疫熒光染色觀察Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)和細(xì)胞中GFAP 水平分別取QMMuC-1細(xì)胞或BV2 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1 d 后吸出培養(yǎng)液，PBS 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。4%多聚甲醛常溫固定30 min，PBS 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。1% BSA 常溫?fù)u床封閉1 h，PBS 緩沖液漂洗1 次，每次5 min。加入GS、GFAP 或Iba-1 一 抗 工 作 液（1∶200，1% BSA 配置），陰性對(duì)照用PBS 緩沖液代替，4 ℃過夜。次日吸出一抗，PBS 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。加入1∶1 000 生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 或山羊抗兔IgG 二抗工作液，常溫避光孵育1 h。吸出二抗，PBS 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。DAPI 染核（1∶1 000，1% BSA 配置），常溫避光孵育30 min。蔡司共聚焦熒光顯微鏡下觀察Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。采用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度代表Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP水平。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測Müller 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平分別設(shè)計(jì)IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因引物。從培養(yǎng)箱中取出6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS 緩沖液漂洗2次，每次5 min，然后每孔分別加入1 mol·L－1TRIzol RNA提取試劑，采用常規(guī)酚/氯仿法提取細(xì)胞中總RNA，測定其濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。上樣量為1 μg，最后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA 以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：ddH O 6 μL，2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，通用型引物2 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)在熒光定量PCR 儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、10 min， 95 ℃、10 s，2 ℃、20 s， 72 ℃、10 s，循環(huán)數(shù)為40 次。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graph Pad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Müller 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平及GFAP 水平符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光染色法觀察Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)免疫熒光染色法觀察QMMuC-1 細(xì)胞表達(dá)Müller 細(xì)胞標(biāo)志物GS 和GFAP 情況，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，QMMuC-1 細(xì)胞表達(dá)GS 和GFAP 明顯。免疫熒光染色方法檢測BV2 細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1 情況，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，BV2 細(xì)胞表達(dá)Iba-1 明顯，見圖1 和2。

圖1 免疫熒光染色法觀察Müller 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(Bar= 100 μm)Fig.1 Morphology of Müller cells observed by immunofluorescence staining(Bar= 100 μm)

圖2 免疫熒光染色法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(Bar=100 μm)Fig.2 Morphology of microglia observed by immunofluorescence staining(Bar=100 μm)

2.2 各組細(xì)胞中GFAP 水平與單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組比較，單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞中GFAP 水平升高1.7 倍（P=0.005）。與共培養(yǎng)對(duì)照組比較，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞中GFAP 水平升高2 倍（P=0.003），細(xì)胞形態(tài)逐漸變成梭形。與單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組比較，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞大部分呈現(xiàn)梭形，GFAP 水平升高1.4 倍（P=0.000 6）。見圖3。

圖3 各組QMMuC-1 細(xì)胞中GFAP 表達(dá)情況(Bar=100 μm)Fig.3 Expressions of GFAP in QMMuC-1 cells in various groups(Bar=100 μm)

2.3 各 組Müller 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA 表達(dá)水平與單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照組比較，單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與共培養(yǎng)對(duì)照組比較，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平升高（P<0.05）， 分別升高了（3.4±0.8）、（3.0±0.6） 和（6.2±0.9） 倍。與單獨(dú)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組比較，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組QMMuC-1 細(xì)胞中IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平升高（P<0.05），分 別 升 高 了（2.3±0.5） 倍 和（3.6±0.5） 倍；IL-6 表達(dá)水平升高（1.8±0.4）倍，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組QMMuC-1 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of L-1β,IL-6,and TNF-α mRNA in QMMuC-1 cells in various groups

3 討 論

LI 等［6］觀察到糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞膠質(zhì)增生和小膠質(zhì)細(xì)胞活化。HU 等［7］采用慢性高眼壓小鼠的Müller 細(xì)胞，通過ATP/P2X7 受體途徑誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而后者激活導(dǎo)致了促炎因子TNF-α 和IL-6 mRNA 和蛋白水平升高，進(jìn)而又通過正反饋方式引起Müller 細(xì)胞中促炎因子mRNA 表達(dá)水平升高。有學(xué)者［8］也證明了小膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)吞噬，在無小膠質(zhì)細(xì)胞的情況下，視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞起反應(yīng)性代償作用。因此，在視網(wǎng)膜病變過程中，Müller 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用仍需進(jìn)一步明確。

Müller 細(xì)胞是視網(wǎng)膜中固有的一類細(xì)胞，與其他視網(wǎng)膜神經(jīng)元均來自同一個(gè)神經(jīng)祖細(xì)胞，可以對(duì)神經(jīng)元起到營養(yǎng)、支持和提高突觸傳導(dǎo)效率等功能［9-10］。小鼠Müller 細(xì)胞QMMuC-1 是研究Müller細(xì)胞病理生理學(xué)的重要工具［11］。本研究采用免疫熒光染色法對(duì)2 種細(xì)胞進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示：QMMuC-1 細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GS 和GFAP陽性，BV2 細(xì)胞表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1 陽性。Müller 細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的作用目前尚存爭議：一方面，活化的Müller 細(xì)胞會(huì)持續(xù)分泌炎癥因子，加劇病變視網(wǎng)膜局部炎癥微環(huán)境，不利于神經(jīng)元存活；另一方面，分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子又能保護(hù)神經(jīng)元。因此，Müller 細(xì)胞具體在炎癥反應(yīng)中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

研究［12-13］顯示：小鼠Müller 細(xì)胞通常通過反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生而非神經(jīng)再生反應(yīng)來對(duì)視網(wǎng)膜損傷做出反應(yīng)， TNF-α 誘導(dǎo)了相關(guān)炎癥和增殖相關(guān)基因的上調(diào)。本研究結(jié)果顯示：單獨(dú)QMMuC-1 細(xì)胞培養(yǎng)不能快速有效地響應(yīng)LPS 誘導(dǎo)的炎癥刺激；當(dāng)BV2 細(xì)胞存在時(shí)，QMMuC-1 細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)明顯，提示小膠質(zhì)細(xì)胞存在對(duì)Müller 細(xì)胞的影響，并可能是由于一系列炎癥因子的產(chǎn)生所致。

研究［14-15］顯示：在正常小鼠視網(wǎng)膜中，GFAP主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，較少在Müller 細(xì)胞中表達(dá)。在神經(jīng)退行性疾病的病變區(qū)域中小膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖，且形態(tài)發(fā)生明顯改變，如小膠質(zhì)細(xì)胞突起分支數(shù)目減少、回縮和胞體增大［16］，同時(shí)伴隨炎癥因子的表達(dá)異常升高［2，17］。在視網(wǎng)膜退行性疾病小鼠視網(wǎng)膜中也發(fā)現(xiàn)類似的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性激活［18-19］。本 課 題 組 前 期 研 究［13-14］明 確 了 小 膠 質(zhì) 細(xì)胞在小鼠中的反應(yīng)性激活現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)Müller 細(xì)胞中GFAP 水平升高，但Müller 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用及其機(jī)制尚不明確。本研究采用免疫熒光法檢測QMMuC-1 細(xì)胞中GFAP 表達(dá)，結(jié)果顯示：小膠質(zhì)細(xì)胞的存在對(duì)于Müller 細(xì)胞功能的發(fā)揮產(chǎn)生明顯作用。最近的研究［20］結(jié)論也與本研究一致。

綜上所述，在視網(wǎng)膜病變或者炎癥刺激時(shí)，Müller 細(xì)胞可能并非直接應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，而是小膠質(zhì)細(xì)胞激活后作用于Müller 細(xì)胞。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可能又釋放了某些炎癥信號(hào)分子，進(jìn)而誘導(dǎo)了Müller 細(xì)胞活化。但Müller 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用尚不清楚，本課題組后續(xù)將針對(duì)2 種細(xì)胞之間的信息傳遞進(jìn)行深入研究。