人lncRNA-GACAT2 過表達載體的構建及其對肺癌細胞增殖和干性的影響

倪 娜, 董洪亮, 高海洋, 陳微微, 孟新宇, 崔冰潔, 杜 靜

（1.濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心，山東 濱州 256603；2.濱州醫學院附屬醫院急診重癥監護室，山東 濱州 256603）

全世界每年有140 萬人死于肺癌，近80%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1-2］。目前手術切除是早期NSCLC 的唯一治療方法。然而，約50%手術患者出現復發［3］。NSCLC 患者的預后較差，5 年生存率僅為15%［4］。因此，尋找更準確的預測NSCLC 的生物標志物對進一步了解NSCLC 細胞生物學和開發新的治療策略有重要的臨床價值。長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度>200 個核苷酸的非編碼蛋白RNA 分子的總稱［5］。近年來，多項研究［6-8］顯示：lncRNA 參與基因表達和蛋白修 飾， 并 與 多 種 疾 病 有 關。 研 究［9-10］顯 示：lncRNA 部分與腫瘤轉移、細胞侵襲和不良預后有關。研 究［11］顯 示：NSCLC 組 織 和 血 液 循 環 中lncRNA 失調與癌癥的發生發展有關。本課題組前期研究［12］顯示：lncRNA SOX2 重疊轉錄（SOX2 over lapping transcript，SOX2-OT） 可以通過人下游轉錄因子Gli1 介導的上皮間質轉化調控人肺癌H520 細胞遷移。因此，探討lncRNA 參與NSCLC發生發展的潛在機制可為NSCLC 患者早期診斷、靶向治療和改善預后提供依據。

lncRNA HNlincRNA717 被人類基因命名委員會 （HUGO Gene Nomenclature Committee，HGNC） 命名為胃癌相關轉錄本2（gastric cancer related transcript 2，GACAT2）基因，該基因定位于人類18 號染色體p11.22，長度為818 bp［13］。該基因的表達與胃癌的發生發展相關，其在胃癌組織和胃癌相關細胞中呈低表達，且該基因表達下調與腫瘤遠處轉移、靜脈侵犯和神經周圍侵犯有關。關于GACAT2 基因在肺癌中表達和作用的報道較少，XIE 等［14］發 現： NSCLC 組 織 和 細 胞 中GACAT2基因表達水平降低，且其表達水平下調與患者不良預后相關。目前，尚無采用基因修飾對GACAT2基因進行細胞層面的功能和機制研究，本研究采用基因工程克隆技術，構建了GACAT2 基因的真核表達載體pc3.1-GACAT2，并將其轉染至肺癌A549 及肺癌H1299 細胞中，建立了穩定表達GACAT2 基因的A549 和H1299 細胞，并采用細胞增殖、克隆形成及干細胞成球實驗評價GACAT2基因對細胞增殖和腫瘤細胞干性的調節作用，旨在為研究GACAT2 基因在肺癌發生發展中的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肺癌A549 和H1299 細胞由濱州醫學院附屬醫院醫學研究中心平臺保存。DMEM （高糖） 培養基（以色列 BI 公司），LONSA 胎牛血清（山東增峰生物技術有限公司），細胞因子50×B27（美國Gibco 公司），表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國PeproTech 公司），大腸埃希菌DH5α［天根生化（北京） 科技有限公司］、限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ（大連寶生物工 程 有 限 公 司）、 ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit 一步法克隆試劑盒（諾維贊生物科技股份有限公司），總RNA 提取試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司），逆轉錄試劑盒［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，Q5 超保真DNA 聚合酶［美國New England Biolabs （NEB） 公 司］， 2×Taq Master Mix 和SYBR qPCR 試劑盒（近岸蛋白科技有限公司）， Axygen 中量質粒提取試劑盒［康寧生命科學（吳江） 有限公司］，凝膠回收試劑盒（美國 Omega 公司），表達載體pc3.1（+） 質粒（ 美 國 Invitrogen Life Technologies 公 司），Lipofectamine 3000 （上海Invitrogen 生命技術公司），CCK-8 試劑盒（美國Med Chem Express 公司）。基因擴增儀（德國Eppendorf 公司），倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR） 儀和凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司），引物DNA 合成和載體DNA 測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 RNA 提取和逆轉錄采用總RNA 提取試劑盒收集細胞中總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，置于－20 ℃保存備用。

1.3 引物設計根據GenBank 已發表的GACAT2基因保守序列，采用南京喏維贊生物科技公司官網提供的引物設計網頁進行引物設計，酶切位點分別為XhoⅠ和HindⅢ，引物序列：GACAT2 基因上游引物5'-CTAGCGTTTAAACTTAAGCTTACAATAAATAAAACAGTTGGTGTCAATACA-3'，GACAT2 基因下游引物5'-AACGGGCCCTCTAGACTCGAGAATATTTAAAATGTTTATTTCATAAGCACTG-3' （下劃線部分為酶切位點）。

1.4 pc3.1-GACAT2 真核表達載體的構建以制備 的cDNA 為 模 板， 采 用RT-qPCR 法 擴 增GACAT2 基因，在微量離心管中加入下列試劑（50 μL 體系）：5×Q5 Reation Buffer 10 μL，dNTP（10 mol·L－1） 1.0 μ L， cDNA （200 ng） 5 μL，Q5 DNA polymerase （2 000 U·L－1） 0.5 μL，ddH2O 37.0 μL。PCR 反 應 程 序： 94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35 個循環；72 ℃、10 min，4 ℃保存。通過電泳驗證片段大小，瓊脂糖凝膠回收試劑盒將擴增產物回收后，空質粒pc3.1（+）及擴增出來的GACAT2 基因片段同時采用HindⅢ和XhoⅠ進行雙酶切，然后將酶切產物采用一步法克隆試劑盒進行連接。將連接后的反應產物轉化至DH5α 感受態細胞，轉化菌液均勻涂布于LB 固體培養基（含50 mg·L－1氨芐青霉素）上，37 ℃倒置過夜培養。次日挑取生長的單個菌落置入LB 培養液（含50 mg·L－1氨芐青霉素）中進行培養，菌液PCR 法進行陽性克隆鑒定，并提取質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序后進行DNA 序列比對分析。

1.5 細胞培養和轉染采用含10% 胎牛血清的DMEM（高糖）培養基培養肺癌A549 和H1299 細胞，于37 ℃、5%CO2的環境中培養。收集處于對數生長期細胞，使細胞密度達到1.0×105mL－1，按2 mL/孔的密度將細胞鋪于6 孔細胞培養板中，待次日細胞密度達80%～90%時進行轉染。細胞分為空載體組（轉染pc3.1 空載體） 和pc3.1-GACAT2 組（轉染pc3.1-GACAT2 重組質粒），并按照脂質體轉染試劑盒說明書進行轉染。

1.6 GACAT2 過表達穩定株的篩選G418 最佳作用濃度篩選：將A549 和H1299 細胞傳代接種至24 孔細胞培養板，使每孔細胞的覆蓋率達約60%，分為未轉染組、轉染pc3.1 空載體組和轉染pc3.1-GACAT2 組， 48 h 后每組分別加入G418，使其終濃度分別為0、200、400、600、800和1 000 mg·L－1，連續觀察4～7 d 后，選取能導致未轉染組細胞完全死亡的G418 濃度作為后續篩選重組質粒細胞克隆的最佳工作濃度，其中A549 細胞最佳工作濃度為200 mg·L－1，H1299 細 胞 最 佳 工 作 濃 度 為400 mg·L－1。

穩定株的篩選：根據篩選出的最佳G418 作用濃度轉染pc3.1 空載體和pc3.1-GACAT2 重組質粒的A549 和H1299 細胞直至獲得穩定存活的細胞，并將細胞分別命名為空載體組（轉染pc3.1 空載體） 和pc3.1-GACAT2 組（轉染pc3.1-GACAT2重組質粒）。

1.7 RT-qPCR 法檢測2 組A549 和H1299 細胞中GACAT2 mRNA 表達水平 分別收集“1.6”中空載體組和pc3.1-GACAT2 組細胞，按照“1.2”中步驟提取細胞中總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒說明書將總RNA 逆轉錄成cDNA，采用RT-qPCR法檢測A549 和H1299 細胞中GACAT2 mRNA 表達水平，以GAPDH 作為內參基因。PCR 法反應條件：95 ℃、10 s； 95 ℃、5 s，57 ℃、 30 s，38 個循環。引 物 序 列： GACAT2 上 游 引 物5'-TTATCCTGAACCGCCACGC-3'， GACAT2下游引物5'-TCCAGACAGCAGGAGGAAATG-3'；GAPDH 上 游 引 物5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'， GAPDH 下 游 引 物5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。根據標準曲線和熒光曲線的Ct 值，采用2－ΔΔCt法計算A549 和H1299 細胞中GACAT2 mRNA 表達水平。

1.8 CCK-8 法檢測2 組細胞增殖活性將空載體組 和pc3.1-GACAT2 組 細 胞（A549 和H1299 細胞）采用胰酶消化后進行細胞計數， 按照每孔3 000 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，每組設6 個平行復孔。采用CCK-8 法分別檢測細胞在12、24、36 和48 h 時的增殖活性。采用酶標儀在450 nm 處測定各孔的吸光度（A）值，以僅加入培養液的空白孔為對照孔調零。以A 值代表各組細胞的增殖活性。

1.9 細胞克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成數將空載體組和pc3.1-GACAT2 組A549 或H1299 細胞經胰酶消化后重懸，按照每孔700 個細胞接種于6 孔細胞培養板，每組設3 個復孔，培養10 d 后取出棄掉培養基，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，以多聚甲醛固定15 min，PBS 緩沖液洗滌2 次然后采用結晶紫染色20 min，吸掉結晶紫溶液，最后采用流動的清水洗掉結晶紫后晾干，采用凝膠成像系統Coomassie Blue 應用程序對培養板進行拍照。采用Image J 軟件統計細胞克隆形成數。

1.10 干細胞成球實驗觀察2 組細胞成球數配制干細胞成球培養基，不含血清的DMEM （高糖）培養基中添加2% 50× B27、EGF 和bFGF，其中EGF 和bFGF 的終濃度均為20 μg·L－1，將空載體組和pc3.1-GACAT2 組A549 及H1299 細胞經胰酶消化后懸浮在干細胞成球培養基中，并接種于低黏附性的12 孔細胞培養板中，每孔接種1 000 個細胞，每隔3 d 按照半量換液法更換新鮮培養基，培養10 d 后觀察細胞成球情況并拍照，統計直徑>75 μm 的細胞球數。

1.11 統計學分析采用Graphpad Prism 6.0 統計軟件進行統計學分析。2 組細胞中GACAT2 RNA表達水平、克隆形成數和細胞成球數以±s表示，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t檢驗；不同時間點細胞中GACAT2 RNA 表達水平、細胞克隆形成數和細胞成球數比較采用雙因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GACAT2 基因擴增和真核表達載體酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：擴增得到長度為835 bp 的GACAT2 特異基因片段。真核表達載體pc3.1 經雙酶切后產生1 個長度為5 400 bp 片段。將GACAT2 目的基因與pc3.1 酶切產物進行切膠回收后，進行連接轉化，涂布Amp 平板，挑取單菌落進行擴增后，行PCR 法鑒定，選擇GACAT2 擴增陽性的單克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，通過測序并與GenBank 中序列進行比對，確定重組質粒pc3.1 中插入了GACAT2 完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）基因片段。見圖1。

圖1 pc3.1 酶切產物、GACAT2 基因PCR 產物和菌落PCR 法鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of enzyme digested products of pc3.1, PCR products of GACAT2 gene,and colony PCR identification

2.2 2 組A549 和H1299 細 胞中GACAT2 mRNA表達水平pc3.1-GACAT2 組 A549 細 胞 中GACAT2 mRNA 表達水平（8.12±0.23）明顯高于空載體組（1.00±0.04）（t=30.98，P<0.01）。pc3.1-GACAT2 組H1299 細胞中GACAT2 mRNA表達水平（4.60±0.06） 明顯高于空載體組（1.00±0.06）（t=44.57，P<0.01）。

2.3 2 組A549 和H1299 細胞增殖活性與空載體組比較，72 和96 h 時pc3.1-GACAT2 組A549 細胞增殖活性明顯低于空載體組（P<0.01）。與空載體 組 比 較， 48、72 和96h 時pc3.1-GACAT2 組H1299 細胞增殖活性降低（P<0.01）。見圖2 。

圖2 CCK-8 法檢測不同時間點2 組A549 細胞(A)和H1299 細 胞(B)增 殖 活 性Fig.2 Proliferation activities of A549 and H1299 cells in two groups detected by CCK-8 assay at different time points

2.4 2 組A549 和H1299 細胞克隆形成數與空載體組（40.00 個±1.00 個）比較，pc3.1-GACAT2組A549 細胞克隆較小，克隆形成數（21.00 個±3.22 個）減少（t=5.644，P<0.01）；與空載體組（91.00 個±7.55 個） 比 較，pc3.1-GACAT2 組H1299 細胞克隆較小，克隆形成數（57.67 個±5.67 個）減少（t=3.024，P<0.05）。2 組細胞克隆形成情況見圖3。

圖3 2 組A549 和H1299 細胞克隆形成情況Fig.3 Clone formation numbers of A549 and H1299 cells in two groups

2.5 各組A549 和H1299 細胞成球數與空載體組（9.67 個±1.20 個） 比 較， pc3.1-GACAT2 組A549 細胞成球能力降低，球體偏小，成球數（20.67 個±1.33 個）減少（t=6.128，P<0.01）；與空載體組（5.00 個±0.58 個） 比較，pc3.1-GACAT2 組H1299 細胞成球能力降低，球體偏小，成球數（7.67 個±0.67 個）減少（t=3.024，P<0.05）。2 組細胞成球情況見圖4。

圖4 顯微鏡觀察2 組A549 和H1299 細胞成球情況(×100)Fig.4 Sphere formations of A549 and H1299 cells in two groups observed under microscope（×100)

3 討 論

目前有關lncRNA-GACAT2 基因相關研究較少，其在腫瘤中的具體作用機制目前尚不清楚。相關研究［15-16］顯示：GACAT2 基因在胃癌組織和胃癌相關細胞系中呈低表達，該基因表達下調與腫瘤遠處轉移、靜脈侵犯和神經周圍侵犯有關。有研究［17］顯示：胃癌患者血清中GACAT2 基因呈高表達，手術后患者血清中GACAT2 mRNA 表達水平與淋巴轉移、遠端轉移和神經周圍侵犯呈正相關關系。最新的研究［18］顯示：GACAT2 是線粒體功能的關鍵調節因子，可以在炎癥環境中調節牙周膜干細胞的線粒體功能和牙骨質形成。

本研究首先構建了lncRNA-GACAT2 真核過表達載體，建立了GACAT2 穩定過表達的肺癌A549 和H1299 細胞，CCK-8 實驗檢測結果顯示：GACAT2 過表達抑制A549 和H1299 細胞的增殖能力；克隆形成實驗是評價腫瘤細胞獨立生存能力的一種實驗方法，形成克隆的細胞是貼壁且有增殖活性的細胞，克隆形成數和大小可以反映腫瘤細胞群體依賴性和增殖能力，因拍照儀器不支持彩色成像，本實驗獲取的克隆形成圖片為黑白色。本研究結果顯示：過表達GACAT2 基因可以增強細胞在增殖過程中的群體依賴性，抑制腫瘤細胞的增殖。

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs） 又稱腫瘤起始細胞（tumor initiating cells，TICs），具有維持腫瘤生長的作用，是類似于胚胎干細胞特性的細胞亞群。目前研究對CSCs 的生物學特性有如下共識：①具有自我更新、無限增殖和多向分化能力；②表達某些表面標志性蛋白或具有特異的酶活性；③具有高度致瘤性；④具有高轉移潛能；⑤對多種藥物高度耐受。因此，CSCs 被認為是臨床腫瘤轉移、復發和放化療失敗的主要原因［19］。靶向清除CSCs 已成為當今癌癥治療的重要策略和最前沿方向［20］。研究［21-23］顯示：lncRNAs 在調節CSCs的生物學行為中起重要作用。有研究［24］顯示：lncRNA-DGCR5 在NSCLC CSCs 中呈高表達，敲低DGCR5 后抑制干細胞轉錄因子Sox2、Nanog 和Oct4 表達，DGCR5 可以吸附微小RNA-330-5p（microRNA-330-5p，miR-330-5p），上調其靶基因CD44 的 表 達，從 而 調 節CSCs 的 干 性［24］。腫 瘤 細胞的成球實驗是衡量腫瘤細胞干性的金標準。本研究結果顯示：GACAT2 基因過表達后，A549 和H1299 細胞成球能力明顯降低，表明GACAT2 可以顯著抑制腫瘤細胞的干性，但其具體作用機制還需深入研究。

綜上所述，GACAT2 基因作為一種抑癌基因，在肺癌中發揮重要作用，但其具體作用機制尚不清楚，本研究結果為進一步探討lncRNA-GACAT2調控肺癌發生發展機制和靶向治療提供了依據。