丹皮酚對人骨肉瘤MG-63 細胞增殖、遷移和CXCR4/STAT3通路的影響

吳 琪, 陳建鋒, 李 浩, 文 峰

（1.湖北中醫藥大學臨床技能實訓中心針骨實驗室，湖北 武漢 430000；2.湖北中醫藥大學附屬醫院骨科，湖北 武漢 430000）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種惡性結締組織的骨骼系統腫瘤，研究［1-2］顯示OS 患者5 年生存率低于20%。現階段OS 主要治療手段包括新輔助化療、手術切除和術后輔助化療。盡管化學療法是治療OS 的重要方法之一，但化療的不良反應會增加患者的疼痛并損害患者的其他身體功能。因此尋找有效且不良反應少的新型抗腫瘤藥物一直是醫學界研究的熱點。中草藥在腫瘤的診治方面具有多靶點、多途徑和不良反應少的優勢。丹皮酚是一種中藥活性成分，有較為廣闊的抗腫瘤應用前景［3］。研究［4-5］顯示：趨化因子受體4（chemokinereceptor 4，CXCR4）在OS 患者腫瘤組織中呈異常高表達并與患者存活率有關。CXCR4/信號轉導和轉錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路在調控腫瘤細胞的增殖、周期、遷移和侵襲等方面也起重要的作用［6-7］。但目前關于丹皮酚對OS 細胞中CXCR4/STAT3 通路影響的研究較少，因此本課題組探討丹皮酚通過CXCR4/STAT3 通路對人OS MG-63 細胞的作用，為丹皮酚的體外抗腫瘤機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人 OS MG-63 細胞購自武漢普諾賽公司。丹皮酚購自美國Selleck 公司，對照質粒和CXCR4 過表達質粒均購自北京義翹神州生物有限公司，CCK-8 檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司，轉染試劑Lipofectamin 2000 購自美國Invitrogen 公 司， 放 射 免 疫 沉 淀 法 （radio immunoprecipitation assay，RIPA） 裂解液、蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶生物有限公司，GAPDH、CXCR4、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、STAT3 和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 標記二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司，磷酸化STAT3 （phosphorylated STAT3，p-STAT3） 購自美國CST 公司。離心機和移液槍購自德國Eppendorf 公司，酶標儀購自美國Thermo 公司，超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司，CO2恒溫培養箱購自日本Sanyo 公司。

1.2 細胞培養將MG-63 細胞置于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的MEM 培養基中生長，并置于37 ℃、5%CO2相對飽和濕度的孵育箱中培養。根據細胞生長情況2～3 d 傳代1 次，采用0.25%胰酶消化，取對數生長期生長狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 CCK-8 法檢測細胞存活率取對數生長期生長狀態良好的MG-63 細胞，采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基調整細胞密度至1×105mL－1，接入96 孔細胞培養板，每孔加入100 μL 細胞懸液，實驗分為對照組和不同濃度丹皮酚組。其中不同濃度丹皮酚組分別加入10、20、40、80、160 和320 mg·L－1丹 皮 酚 處 理 細 胞24 h［8］，另設空白孔。實驗重復3 次。加藥培養結束后加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育4 h，于酶標儀450 mm 波長處測定各孔吸光度（A）值，計算細胞存活率。細胞存活率=［（實驗孔A 值－空白孔A 值）/（對照孔A 值－空白孔A 值）］ ×100%。根據細胞存活率選擇半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50） 值，作 為 后 續 實 驗藥物濃度。

1.4 Western blotting 法檢測各組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達水平

按照蛋白提取試劑盒步驟提取細胞總蛋白。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入GAPDH 一抗（1∶20 000 稀釋）、CXCR4 一抗（1∶1 000 稀釋）、IL-6 一抗（1∶500 稀釋）、STAT3 一抗（1∶1 000稀釋）和p-STAT3 一抗（1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次后，加入HRP 標記的二抗（1∶5 000 稀釋），室溫下孵育2 h，TBST 緩沖液清 洗 4 次。 加 入 電 化 學 發 光（electrochemiluminescence，ECL） 顯影 后掃描膠片，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH 條帶灰度值。

1.5 細胞轉染和實驗分組將MG-63 細胞分為對照組、丹皮酚組、丹皮酚+空載組（215.8 mg·L－1丹皮酚+ 空載質粒） 和丹皮酚+ 過表達組（215.8 mg·L－1丹皮酚+CXCR4 過表達質粒）。對照組：MG-63 細胞正常培養； 丹皮酚組：215.8 mg·L－1丹皮酚處理MG-63 細胞；丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組：根據Lipofectamin 2000 轉染試劑說明書分別轉染對照質粒和CXCR4過表達質粒48 h 后加入215.8 mg·L－1丹皮酚處理MG-63 細胞。

1.6 細胞劃痕實驗檢測各組細胞劃痕愈合率實驗分為對照組、丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組。將細胞接種于6 孔細胞培養板上，質粒轉染細胞48 h 后采用10 μL 無菌塑料移液管尖端輕輕刮擦附著的細胞產生單個劃痕。采用無血清培養基洗滌細胞，去除刮起的漂浮細胞，加入含丹皮酚或不含丹皮酚的無血清培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，并于0 和24 h 在顯微鏡下觀察劃痕處細胞生長狀況，采用Image J 軟件分析細胞劃痕愈合率。細胞劃痕愈合率= （0 h 劃痕面積－24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1.7 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成率實驗分為對照組、丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組。將細胞接種于6 孔細胞培養板上，質粒轉染細胞48 h 后收集細胞，以每孔250 個細胞接種于6 孔細胞培養板，待細胞貼壁后棄去原培養基加入含丹皮酚或不含丹皮酚的新鮮培養基，培養14 d 后除去培養皿里的培養液，采用4%多聚甲醛溶液固定細胞20 min，再采用結晶紫常溫下染色30 min，顯微鏡下拍照，計數各組細胞克隆數，計算細胞克隆形成率。細胞克隆形成率=細胞克隆數/250×100%。

1.8 Western blotting 法檢測各組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達水平

實驗分為對照組、丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組。質粒轉染48 h 后加入215.8 mg·L－1丹皮酚繼續處理細胞24 h 后收集各組細胞，采用Western blotting 法檢測各組細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋 白 表 達 水平，方法同“1.4”。

1.9 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組MG-63 細胞存活率、細胞劃痕愈合率、細胞克隆形成率和細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 及STAT3 蛋白表達水平呈正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞存活率和丹皮酚IC50值與對照組比較，40、80、160 和320 mg·L－1丹皮酚組細胞存活率降低（P<0.05），其IC50值為215.8 mg·L－1，選擇215.8 mg·L－1丹皮酚作為后續實驗的藥物濃度。見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測各組MG-63 細胞存活率Fig.1 Survival rates of MG-63 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.2 各組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3和STAT3 蛋白表達水平與對照組比較，丹皮酚（215.8 mg·L－1） 組MG-63 細 胞 中CXCR4、IL-6和p-STAT3 蛋白表達水平降低（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），表明215.8 mg·L－1丹皮酚抑制了MG-63 細胞中CXCR4/STAT3 通路的表達。見圖2。

圖2 各組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.2 Electrophoregram（A）and histogram（B） of expressions of CXCR4, IL-6, p-STAT3， and STAT3 proteins in MG-63 cells in various groups

2.3 各組MG-63 細胞克隆形成率與對照組比較，丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組MG-63 細胞克隆形成率降低（P<0.05）；與丹皮酚組比較，丹皮酚+空載組MG-63 細胞克隆形成率差異無統計學意義（P>0.05），丹皮酚+過表達組MG-63 細胞克隆形成率升高（P<0.05）。見圖3 和4。

圖3 結晶紫染色檢測各組MG-63 細胞平板克隆形成情況Fig.3 Plate clone formation of MG-63 cells in various groups detected by crystal violet staining

圖4 各組MG-63 細胞克隆形成率Fig.4 Clone formation rates of MG-63 cells in various groups

2.4 各組MG-63 細胞劃痕愈合率與對照組比較，丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組MG-63 細胞劃痕愈合率降低（P<0.05）；與丹皮酚組比較，丹皮酚+空載組MG-63 細胞劃痕愈合率差異無統計學意義（P>0.05），丹皮酚+過表達組MG-63 細胞劃痕愈合率升高（P<0.05）。見圖5 和6。

圖5 各組MG-63 細胞遷移情況（×200）Fig.5 Migration of MG-63 cells in various groups（×200）

圖6 各組MG-63 細胞劃痕愈合率Fig.6 Scratch healing rates of MG-63 cells in various groups

圖7 各組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達電泳圖（A）及直條圖(B)Fig.7 Electrophoregram（A）and histogram（B） of expressions of CXCR4, IL-6, p-STAT3，and STAT3 proteins in MG-63 cells in various groups

2.5 各 組MG-63 細 胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3和STAT3 蛋白表達水平與對照組比較，丹皮酚組、丹皮酚+空載組和丹皮酚+過表達組MG-63細胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平降低（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）；與丹皮酚組比較，丹皮酚+空載組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），丹皮酚+過表達組MG-63 細胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平升高（P<0.05），STAT3 蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。

3 討 論

OS 患者的預后較差，容易復發或遠處轉移，發病人數約占骨惡性腫瘤的30%。目前對于OS 的治療，一般術前化療，然后行局部廣泛切除的保肢術或行截肢術及術后化療［9-10］。但化療的不良反應會增加患者的疼痛并損害患者的其他身體功能。因此，需要尋找新型的治療藥物，一方面能對OS 細胞有較好的抗腫瘤效果，另一方面是不良反應少，從而進一步改善患者的預后。

中藥因多靶點、多途徑和不良反應少等特點在腫瘤的治療中逐漸顯示出一定的優勢。近年來臨床研究［11-12］顯示：中醫藥聯合手術、化療和放療等對腫瘤治療有良好的效果。目前已有眾多關于中醫藥抗骨肉瘤的臨床及基礎實驗報道，中醫藥抗OS的作用機制不斷被闡明［13］。丹皮酚具有鎮痛、抗炎、抗氧化、抗過敏和抗病毒等藥理作用，臨床常用于治療心腦血管、炎癥和皮膚等疾病［3］。近些年研究也揭示丹皮酚還具有一定的抗腫瘤作用，對腫瘤有良好的治療效果。LI 等［14］研究了丹皮酚對阿帕替尼耐藥胃癌細胞的作用機制，其研究結果證實：丹皮酚能通過長鏈內含子RNA00665 （long intergenic non-coding RNA 00665， linc RNA 00665）/微 小 RNA-665 （microRNA-665， miR-665）/促分裂素原活化蛋白激酶1 （mitogen activated protein kinase 1，MAPK1）軸抑制阿帕替尼耐藥的胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解，促進細胞凋亡。ZHANG 等［15］研究證實：丹皮酚能通過調控STAT3/核因子κB （nuclear factor kappa B，NF-κB） 通路抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，表明丹皮酚可作為一種腫瘤化療抗轉移候選藥物。CAI 等［16］研究顯示：丹皮酚通過調節肝癌細胞中的微小RNA-21-5p（microRNA-21-5p， miR-21-5p）/Kruppel 樣 因 子6 （Kruppel like factor 8，KLF6） 軸進而抑制肝癌細胞活力、遷移和侵襲并引發肝癌細胞凋亡。細胞增殖是機體極為重要的基本生命特征，正常細胞增殖受到機體內嚴格調控，而不受機體控制且無限制的惡性細胞增殖則是腫瘤細胞的主要特征。因此有效控制腫瘤細胞的惡性增殖是評估藥物可否作為抗腫瘤藥物的主要指標之一。本研究結果顯示：丹皮酚對OS MG-63 細胞活力有明顯的抑制作用，表明丹皮酚對OS 有一定的治療作用。

CXCR4 作為機體中極為重要的趨化因子受體，研究［4-5］顯示：CXCR4 在骨肉瘤患者腫瘤組織中異常高表達且其表達量與患者存活率有關。CXCR4 參與了免疫細胞的募集，誘導IL-6 炎性細胞因子分泌增多， IL-6 與可溶性IL-6 受體（soluble IL-6 receptor，sIL-6R） 結合形成復合物，IL-6/sIL-6R 復合物能結合誘導細胞膜表面的糖蛋白130（glycoprotein 130，gp130）同源二聚，形成高親和力的IL-6/sIL-6R/gp130 功能性受體復合物，進而導致Janus 激酶（Janus kinases，JAKs） 磷酸化而被激活，JAKs 活化可進一步導致STAT3 磷酸化［17-20］。STAT3 作 為STATs 家 族 的 極 為 重 要 的 關鍵成員，在多種腫瘤組織中異常激活。STAT3 被激活從細胞質中轉移至細胞核并與特異性DNA 序列結合后通過調節下游靶基因的表達，進而促進腫瘤細胞抗凋亡、遷移侵襲和血管形成等能力，增強細胞的致癌作用［21-23］。本研究結果顯示：丹皮酚處理后，MG-63 細胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平降低，說明丹皮酚抑制了MG-63 細胞中CXCR4/STAT3 通路的表達。克隆形成率可以反映細胞群體依賴性和增殖能力，也可以較好地反映腫瘤的惡性程度，可較為簡便而靈敏地檢測藥物引起的抑瘤性和促瘤性。腫瘤細胞具有向遠處組織轉移的能力，從而使腫瘤細胞可以從原位病灶脫離。細胞劃痕實驗是測定腫瘤細胞的遷移運動能力的方法，細胞劃痕愈合率是評估腫瘤細胞遷移能力的重要指標。CXCR4/STAT3 通路改變對細胞的增殖和遷移等方面有一定的調控作用［6-7］。本文作者采用細胞克隆形成實驗和細胞劃痕實驗發現丹皮酚能夠降低MG-63 細胞的克隆形成率和劃痕愈合率，說明丹皮酚可能通過抑制CXCR4/STAT3 通路進而調控MG-63 細胞的克隆形成和遷移能力。為了明確丹皮酚調控CXCR4/STAT3 通路可能是其抑制MG-63 細胞克隆形成及遷移能力的分子機制之一，本研究在MG-63 細胞中過表達CXCR4，發現CXCR4 過表達明顯逆轉了丹皮酚對CXCR4/STAT3 通路的抑制作用，增加MG-63 細胞中CXCR4、IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平，重新激活了CXCR4/STAT3 通路。CXCR4 過表達亦明顯逆轉了丹皮酚對MG-63 細胞的克隆形成和遷移的抑制作用，提高了MG-63 細胞的克隆形成和遷移能力，表明丹皮酚能夠通過調控MG-63 細胞中CXCR4/STAT3 通路而起到良好的抗腫瘤作用。綜上所述，調控CXCR4/STAT3 通路可能是丹皮酚抑制MG-63 細胞增殖、克隆形成和遷移能力的分子機制之一。