CXC 趨化因子配體10 對(duì)肝細(xì)胞癌SMMC-7721 細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制

鄧文俊, 胡連濤, 趙彬男, 董新宇, 李學(xué)斌, 李 杰, 楊馨妍, 郭曉莉, 李 玥,曲義坤, 王偉群

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省微生物-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007；4.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007；5.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 佳木斯 154007）

原發(fā)性肝癌目前被認(rèn)為是全球人類最常見的十大癌癥類型之一，患病率位居所有癌癥的第4 位，其中90% 以上原發(fā)性肝癌為原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1］。目前HCC 患者采用的治療方式相對(duì)比較單一，患者在確診時(shí)已大多發(fā)展到中晚期，療效有限，治療后復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致HCC 的高死亡率［2］。因此，尋找HCC 潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)其的防治至關(guān)重要。CXC 趨化因子 配 體10 （CXC chemokine ligand 10，CXCL10）又稱INP10，位于人類第4 號(hào)染色體q21 區(qū)，能夠與受體CXCR3 結(jié)合，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3-4］。HCC 組織中CXCL10 表達(dá)水平明顯高于正常組織，同 時(shí)CXCL10 能 夠 影 響HCC 患 者 的 預(yù) 后［5］，CXCL10 可能成為HCC 治療的生物標(biāo)志物，但CXCL10 促進(jìn)HCC 發(fā)展的機(jī)制尚不明確。本研究探討CXCL10 對(duì)HCC 細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其作用機(jī)制，為篩選HCC 的治療靶點(diǎn)和研究CXCL10 在腫瘤進(jìn)展中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人HCC SMMC-7721細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（以色列BI 公司），胰蛋白酶、CCK-8 增殖試劑盒、EdU-555 細(xì)胞增殖試劑盒、結(jié)晶紫、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝膠配制試劑盒和ECL 超敏發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），重組人CXCL10（美國Pepro Tech 公司），脫脂奶粉（美國BD公司），聚偏二氟乙烯（hydrophobic polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜（美國Milipore公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）和辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（武漢博士德生物公司），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase， ERK）、 磷 酸 化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK） 和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）單克隆抗體（上海Abways 公司），ERK 抑制劑PD98059（美國Selleck 公司），β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物公司），蛋白Marker（美國Thermo 公司）。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司），垂直蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、圖像采集和分析系統(tǒng)（上海天能公司），熒光顯微鏡（德國Leica公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組SMMC-7721 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，每2 d 換液1 次，細(xì)胞長至80%密度時(shí)，胰蛋白酶消化后傳代。細(xì)胞按照CXCL10 濃度分為0 mg·L－1CXCL10 組、10 mg·L－1CXCL10 組 和30 mg·L－1CXCL10 組。上述部分細(xì)胞給予ERK 抑制劑PD98059（80 μmol·L－1）處理后，將SMMC-7721 細(xì) 胞 分 為0 mg·L－1CXCL10+PD98059 組、10 mg·L－1CXCL10+PD98059 組 和 30 mg·L－1CXCL10+PD98059 組。

1.3 CCK-8 法檢測各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率常規(guī)培養(yǎng)SMMC-7721 細(xì)胞后，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為3×104mL－1，每孔100 μL 培養(yǎng)體系，置于含5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后按照分組加入CXCL10 溶液，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h 后加入CCK-8 溶液，每孔10 μL，37 ℃溫箱避光孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=（處理組細(xì)胞A 值/對(duì)照組細(xì)胞A 值）×100%。

1.4 EdU 法 檢測各 組SMMC-7721 細(xì)胞 中EdU 陽性表達(dá)率取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為5×104mL－1，每孔500 μL，細(xì)胞貼壁后加入CXCL10 溶液，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；按照說明書，每孔加入500 μL 2×EdU 工作液，37 ℃溫箱孵育4 h 后去除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗滌3 次，通透液室溫孵育15 min，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗滌2 次，每孔加入500 μL Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min后去除，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗滌3 次，每孔加入500 μL Hoechst 33342 染核，室溫避光孵育10 min 后去除染色液，加入含3%BSA 的PBS 溶液洗滌3×5 min 后采用熒光顯微鏡觀察各組SMMC-7721 細(xì)胞中EdU 陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU 陽性表達(dá)率。 EdU 陽 性 表 達(dá) 率= （EdU 陽 性 細(xì) 胞 數(shù)/Hoechst 33342 陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測各組SMMC-7721 細(xì)胞遷移率取2×104個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721 細(xì)胞接種于Transwell 小室上室中，細(xì)胞培養(yǎng)于100 μL 無 FBS 的培養(yǎng)基中；下室每孔加入600 μL 含20% FBS 和CXCL10 溶液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后棄去上室中培養(yǎng)基，PBS 溶液洗滌3 次，棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色30 min；三蒸水搖床洗滌后稍晾干，于顯微鏡下觀察和拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=遷移細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 Western blotting 法檢測各組SMMC-7721 細(xì)胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，CXCL10溶液處理24 h 后提取蛋白，取 20 μg 總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 凝膠中電泳，80 V 恒壓使溴酚藍(lán)電泳至濃縮膠與分離膠交界處，待蛋白Marker 出現(xiàn)后改用120 V 電壓直至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部；270 mA 電流轉(zhuǎn)膜，使蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上；采用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液于37 ℃封閉 1 h；加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3×10 min；加入二抗（1∶5 000） 37 ℃孵育1 h；TBST 洗膜 3×10 min；ECL 顯影液作用于 PVDF膜上，并將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中顯影和拍照。Image J 軟件檢測各蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組SMMC-7721細(xì)胞增殖率，細(xì)胞中EdU 陽性表達(dá)率，細(xì)胞遷移率，SMMC-7721 細(xì)胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率和細(xì)胞中EdU陽性表達(dá)率CXCL10 培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，CCK-8 法檢測結(jié)果顯示：與0 mg·L－1CXCL10 組比較，10 mg·L－1CXCL10 組（112.45%±3.21%） 和30 mg·L－1CXCL10 組 細(xì) 胞 增 殖 率（125.62%±4.38%）升高（P<0.05 或P<0.01），以30 mg·L－1CXCL10 組細(xì)胞增殖率升高更明顯（P<0.01）。見 圖1。EdU 法 檢 測 結(jié) 果 顯 示：與0 mg·L－1CXCL10 組（14.91%±2.78%）比較，10 mg·L－1CXCL10 組 （26.85%±3.58%） 和30 mg·L－1CXCL10 組（36.90%±2.98%）SMMC-7721 細(xì)胞中EdU 陽性表達(dá)率明顯升高（P<0.01）。見圖2。

圖1 各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率Fig.1 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups

圖2 各組SMMC-7721 細(xì)胞中EdU 陽性細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)（Hoechst 33342,×100）Fig.2 Morphology of EdU positive cells in SMMC-7721 cells in various groups（Hoechst 33342,×100）

2.2 各組SMMC-7721 細(xì)胞遷移率培養(yǎng)48 h 后，與0 mg·L－1CXCL10 組（0.76%±0.06%） 比較，10 mg·L－1CXCL10 組 （1.90%±0.14%） 和30 mg·L－1CXCL10 （2.76%±0.12%）細(xì)胞遷移率升高（P<0.01）。見圖3。

圖3 各組SMMC-7721 細(xì)胞遷移形態(tài)表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×200）Fig.3 Morphology of migration of SMMC-7721 cells in various groups（Crystal violet,×200）

2.3 各 組SMMC-7721 細(xì)胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平處理24 h 后，與0 mg·L－1CXCL10組比較，10 mg·L－1CXCL10組和30 mg·L－1CXCL10 組SMMC-7721 細(xì) 胞 中ERK、p-ERK 及Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。見圖4和表1。

表1 各組SMMC-7721 細(xì)胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ERK, p-ERK， and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups (n=3，±s）

表1 各組SMMC-7721 細(xì)胞中ERK、p-ERK 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of ERK, p-ERK， and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups (n=3，±s）

*P<0.01 vs 0 mg·L-1 CXCL10 group；△P<0.01 vs 10 mg·L-1 CXCL10 group.

Group 0 mg·L-1 CXCL10 10 mg·L-1 CXCL10 30 mg·L-1 CXCL10 Cyclin D1 0.64±0.04 1.06±0.03*1.18±0.02*△ERK 0.79±0.02 1.05±0.03*1.21±0.02*△p-ERK 0.90±0.03 1.10±0.02*1.26±0.02*△

圖4 各組SMMC-7721細(xì)胞中ERK、p-ERK和Cyclin D1蛋白表達(dá)電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of ERK,p-ERK,and Cyclin D1 proteins in SMMC-7721 cells in various groups

2.4 ERK 抑制劑處理后各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率加入ERK 抑制劑PD98059 后，與0 mg·L－1CXCL10組比較，10 mg·L－1CXCL10＋PD98059組和30 mg·L－1CXCL10＋PD98059 組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率明顯降低（P<0.05），0 mg·L－1CXCL10+PD98059 組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與10 mg·L－1CXCL10 組比較，10 mg·L－1CXCL10＋PD98059 組SMMC-7721 細(xì) 胞增 殖率降低（P<0.05）；與30 mg·L－1CXCL10 組比 較，30 mg·L－1CXCL10+PD98059 組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率降低（P<0.05）。見表2。

表2 ERK 抑制劑PD98059 處理后各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups after treated with ERK inhibitor PD98059(n=3,±s,η/%)

表2 ERK 抑制劑PD98059 處理后各組SMMC-7721 細(xì)胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of SMMC-7721 cells in various groups after treated with ERK inhibitor PD98059(n=3,±s,η/%)

*P<0.01 vs 0 mg·L-1 CXCL10 group；△P<0.01 vs 10 mg·L-1 CXCL10 group；#P<0.01 vs 30 mg·L-1 CXCL10 group.

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3 討 論

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤難治的關(guān)鍵影響因素，而趨化因子與其受體結(jié)合后可通過影響血管生成、腫瘤微環(huán)境及直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖等過程，進(jìn)而影響腫瘤的惡性進(jìn)程［6-7］。CXCL10 屬于CXC 趨化因子家族，在多種腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮促癌作用。在乳腺癌組織中，CXCL10 能夠通過蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途徑促進(jìn)親代乳腺癌MCF7 細(xì)胞和他莫昔芬耐藥乳腺癌MCF7 細(xì)胞的增殖［8］；在胃癌患者中，CXCL10 高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)［9］；神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也可發(fā)現(xiàn)CXCL10 及其受體CXCR3 高表達(dá)，且表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)［10］。在肝癌組織中，缺乏CXCL10 的小鼠能夠通過減少腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤血管形成減緩肝癌的形成，提示CXCL10 可能是肝癌形成的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示：CXCL10 能夠促進(jìn)體外HCC SMMC-7721 細(xì)胞的增殖。遷移能力可用來評(píng)價(jià)腫瘤的轉(zhuǎn)移程度，腫瘤的轉(zhuǎn)移直接影響治療和預(yù)后。研究［11］顯示：CXCL10 能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞向神經(jīng)元遷移；CXCL10 還能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移［12］。本研究結(jié)果顯示：CXCL10能夠增強(qiáng)HCC SMMC-7721 細(xì)胞的遷移能力，這與TSUTSUMI 等［13］的研究結(jié)果一致。

ERK 是屬于絲裂原活性蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs） 家族的成員，ERK 進(jìn)入細(xì)胞核后可以通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的正常表達(dá)，影響細(xì)胞的正常生長、發(fā)育、增殖、分化、遷移和凋亡誘導(dǎo)等過程［14］。在肝癌［15-16］等腫瘤組織中，ERK 高表達(dá)，其能夠通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞遷移引起腫瘤惡性進(jìn)程［17］。研究［18］顯示：CXCL10 可以促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，肝纖維化是形成肝癌的危險(xiǎn)因素，而在肝癌組織中CXCL10與ERK 之間的關(guān)系尚不清楚。本研究結(jié)果顯示：CXCL10 能夠促進(jìn)HCC SMMC-7721 細(xì)胞中ERK磷酸化，ERK 可能是CXCL10 促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)鍵分子。 活化的ERK 可以誘導(dǎo)Cyclin D1 表達(dá)，抑制P27 蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S 期過渡，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖分裂［19］。本 研 究 結(jié) 果 顯 示：CXCL10 在 激 活ERK 的磷酸化后進(jìn)一步激活下游Cyclin D1 的表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)SMMC-7721 細(xì)胞增殖的作用。PD98059 是一種特異性ERK 抑制劑，可以通過抑制MEK 和ERK 的 表 達(dá) 抑 制MAPK 通 路［20］。本 研 究 結(jié) 果 顯示：加入PD98059 后，CXCL10 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞的增殖作用明顯減弱，進(jìn)一步證明ERK 在CXCL10 促進(jìn)SMMC-7721 細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，CXCL10 可以通過ERK/p-ERK/Cyclin D1 通路促進(jìn)HCC SMMC-7721 細(xì)胞的增殖和遷移，這為CXCL10 成為HCC 治療靶點(diǎn)提供了新的依據(jù)。