基于NLRP3/Caspase-1信號通路探討益腎降糖飲對人腎小球系膜細胞焦亡相關蛋白表達的影響

吳 競，李鵬飛，丘余良，許勇鎮

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004；2.北京中醫藥大學廈門醫院，福建 廈門 361015）

糖尿病腎臟病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的常見并發癥，其主要病理改變之一為腎小球系膜細胞增生、系膜基質增生，已成為我國終末期腎臟病構成的重要因素［1-3］。我國2 型DKD 患者占糖尿病患者總人數的30%～50%［4］。目前DKD的治療主要以控制血壓、血糖、血脂、蛋白尿為主，但這并不能完全阻止DKD 進展，目前仍缺乏能有效防治或逆轉DKD 病程的藥物及方案。

細胞焦亡作為新發現的程序性細胞死亡方式，在DKD 發病中發揮著重要作用［5］。DKD 患者高糖、高胰島素、氧化應激、微炎癥等因素均可誘導NOD 樣受體熱蛋白結構域3（NLRP3）炎癥小體的活化，繼而介導半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）的成熟，促進IL-1β 及IL-18 等炎性因子的釋放，激發細胞炎性反應及細胞焦亡，導致腎臟纖維化［6］。

益腎降糖飲是福建中醫藥大學附屬人民醫院阮詩瑋教授創立，針對DKD 氣陰兩虛證有確切療效［7-10］。本研究觀察益腎降糖飲含藥血清對于高糖高胰島素培養下人腎小球系膜細胞焦亡相關蛋白表達的影響，進而闡明其臨床防治DKD 的分子機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，6～8 周齡，體質量（200±20 g），購自杭州醫學院，生產許可證號碼：SCXK（浙）2019-00052，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物實驗室。飼養條件：環境安靜，自由攝食飲水，溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～60%，光照明暗循環各12 h。本實驗方案經福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核批準（審批號：FJTCM IACUC 2021156）。

1.2 實驗細胞 人腎小球系膜細胞（human mesangial cells，HMC）由北京北納創聯生物技術研究院提供（貨號：bncc341777）。

1.3 實驗藥物 益腎降糖飲為福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑（批號：閩藥制字Z06106053）。藥物組成：何首烏40 g，玄參40 g，生地黃40 g，太子參40 g，黃芪40 g，山藥60 g，肉蓯蓉40 g，僵蠶40 g，當歸40 g，赤芍40 g，蒼術20 g，馬齒莧60 g，黃芩20 g，鮮石橄欖60 g。

1.4 實驗試劑 DMEM 培養基（批號：11965092）、FBS（批號：10270-106）、PBS（批號：10010023）均購自美國Gibco 公司；RIPA 裂解液（批號：P0013B）、PMSF（批號：ST505）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號：P0015L）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（批號：P0012A）、轉印緩沖液（批號：P0021）、電泳液（批號：P0014B）、ECL 化學發光試劑盒（批號：P0018FS）均購自上海碧云天生物技術有限公司；預染蛋白marker（美國Invitrogen 公司，批號：26617）；PVDF 膜（德國Millipore公司，批號：IEVH00005）、Caspase-1 antibody（批號：22915-1-AP）；NLRP3 antibody（批號：19771-1-AP）、GAPDH antibody（批號：60004-1-Ig）均購自Proteintech 公司。

1.5 實驗儀器 冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；制冰機（常熟市雪科電器有限公司）；電泳儀、化學放光儀（上海天能科技有限公司）；純水儀（南京智拓儀器儀表有限公司）；定量PCR 儀、普通PCR 儀（美國ABI 公司）；酶標儀、細胞培養箱（美國Thermo 公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 益腎降糖飲湯藥的制備 本次研究所需益腎降糖飲由福建中醫藥大學附屬人民醫院制劑室自制提供，規格：250 mL/瓶。

2.2 益腎降糖飲含藥血清和空白血清制備 60 只SPF 級雄性SD 大鼠按照隨機數字表法分為空白組和低、中、高劑量組，每組15 只。低、中、高劑量組的給藥量依據人與大鼠體表面積換算方法，分別為人等效劑量的2.5、5、10 倍。大鼠適應性飼養7 d后，空白組給予生理鹽水34 mL/（kg·d）灌胃，低、中、高劑量組分別給予濃度為0.39、0.78、1.56 g/mL益腎降糖飲混懸液34 mL/（kg·d）灌胃，每天2 次，持續7 d。最后1 次灌胃1 h 后，以20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，4 ℃靜置1 h 后離心機離心提取含藥血清和空白血清。收集的血清56 ℃下滅活補體30 min，放入-80 ℃冰箱保存。

2.3 模型制備和分組

2.3.1 HMC 復蘇、傳代 從液氮中取出人腎小球系膜細胞株，迅速復蘇接種于含10%胎牛血清的DMEM（10% FBS、1%雙抗）培養基中，以后每1～2 d完全更換培養液1 次，待細胞長滿后用0.25%胰酶消化，進行細胞傳代，取對數增長期，第3～4 代的細胞進行實驗。

2.3.2 建立體外HMC 模型并分組干預 取生長狀態良好、密度適中的HMC 分為空白組，模型組，低、中、高劑量組?？瞻捉M采用10%的大鼠空白血清DMEM培養基；模型組在4.5 mg/mL葡萄糖、10 μg/mL胰島素誘導后，加濃度為10%大鼠空白血清干預；低、中、高劑量組在4.5 mg/mL 葡萄糖、10 μg/mL 胰島素誘導后，分別加濃度為10%的大鼠含濃度為0.39、0.78、1.56 g/mL 的益腎降糖飲含藥血清干預。5 組細胞置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中，培養48 h。

2.4 觀察指標

2.4.1 qPCR 檢測5組細胞NLPR3、Caspase-1 mRNA相對表達水平 提取5 組細胞中RNA，反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，再運用qPCR 分別檢測Caspase-1、NLPR3、GAPDH mRNA 相對表達水平，引物序列見表1。反應條件為：95 ℃預變性3 min，再以95 ℃，30 s→55 ℃，60 s→72 ℃，30 s 的條件循環擴增35 次。qPCR 是在美國Applied Biosystems公司的StepOne? Real-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3 個復孔，使用EnTurbo? SYBR Green PCR Super-Mix 試劑盒進行（ELK Biotechnology，EQ001），實驗結果采用2-△△Ct的方法進行分析。

表1 引物序列

2.4.2 Western blot 檢測5 組細胞NLPR3、Caspase-1蛋白表達量 收集5 組HMC 蛋白，進行4 次SDSPAGE 電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后顯色、拍照。結果采用ImageJ 軟件分析相對灰度值，并進行統計。

2.5 統計學方法 所有數據采用SPSS 23.0 進行統計分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD 方法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 5組細胞Caspase-1、NLRP3 mRNA 相對表達水平比較 見表2。

表2 5 組細胞Caspase-1、NLRP3 mRNA相對表達水平比較（±s）

表2 5 組細胞Caspase-1、NLRP3 mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05。

NLRP3 1.12±0.19 3.28±0.581）2.52±0.332）2.11±0.262）3）1.64±0.302）3）組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Caspase-1 0.99±0.17 3.07±0.311）2.32±0.282）1.73±0.252）3）1.46±0.222）3）

3.2 5組細胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達量比較 見圖1、表3。

圖1 5 組細胞Caspase-1、NLRP3 蛋白條帶圖

表3 5 組細胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達量比較（±s）

表3 5 組細胞Caspase-1、NLRP3蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05。

NLRP3 0.56±0.04 1.16±0.051）1.05±0.072）0.59±0.042）3）0.45±0.032）3）組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Caspase-1 0.51±0.04 0.66±0.041）0.61±0.07 0.50±0.022）3）0.22±0.042）3）

4 討 論

細胞焦亡是一種促炎程序性細胞死亡方式，由Caspase-1 依賴性介導，釋放大量炎性因子，誘發炎癥反應［11］，其主要特點是細胞質膜完整性喪失，細胞內物質流出［12］。細胞焦亡時，內源性和外源性刺激信號刺激炎癥小體，介導Caspase-1 的成熟和釋放，切割下游GSDMD 蛋白，在膜內側聚集形成孔道，水分子侵入細胞，導致細胞破裂，細胞內物質流出，繼而進一步放大局部和全身炎癥反應［13］。

近年來，糖尿病也被認為是一種免疫炎癥性疾?。?4］，而DKD 也被證實與細胞焦亡、炎癥反應及氧化應激關系密切［15］。WANG 等［16］發現，對于高糖處理的大鼠系膜細胞，其NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達水平均升高，TXNIP/NLRP3 炎癥小體通路活化；沉默TXNIP 可抑制高糖誘導的TXNIP/NLRP3 炎癥小體通路活性，減輕系膜細胞增殖、氧化應激以及細胞外基質沉積。SAMRA 等［17］發現，對于STZ 誘導的糖尿病動物模型，其腎組織NLRP3 表達水平增加，IL-1β 表達水平升高。FENG 等［18］通過免疫組化檢測發現，DKD 大鼠腎臟組織中炎癥小體NLRP3 及炎癥因子IL-1β 高表達，且經高糖培養HMC 后發現NLRP3、Caspase-1 等焦亡相關蛋白陽性率增加，與劑量與時間呈正相關。糖尿病大鼠高血糖、血脂異常、高尿酸等因素協和作用，導致炎癥小體組分NLRP3、Caspase-1 高表達，引起細胞焦亡，產生腎臟損傷及腎臟纖維化［19］。因此，糖尿病腎臟病發生、發展中均伴隨著NLRP3 炎癥小體的活化，其活化因素包括了高糖、氧化應激、微炎癥等多個方面。

阮詩瑋教授認為DKD 基本病機為氣陰兩虛證，結合多年臨床經驗，創立了DKD 氣陰兩虛證基本方——益腎降糖飲，并開展為本院院內制劑。我科通過不同的切入點，設計并完成系列臨床試驗，結果表明該方治療糖尿病腎臟病療效確切，具有抑制炎癥反應、減少蛋白尿及延緩腎功能進展的臨床療效［7-10］。王寶萍［20］研究發現DKD 患者血IL-18、尿IL-18 均高于健康組，且益腎降糖飲能顯著降低氣陰兩虛證DKD 患者血IL-18、尿IL-18 水平，療效優于單純西藥治療。

本研究結果表明：糖尿病高糖及高胰島素狀態可以增加細胞焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1 的表達，細胞內的炎癥反應促進了系膜細胞焦亡的發生。益腎降糖飲可以通過調控NLRP3、Caspase-1以抑制腎小球系膜細胞焦亡。本研究初步闡明了益腎降糖飲改善DKD 患者蛋白尿及腎功能的可能機制，為下一步動物造模體內實驗提供體外初步的實驗證據，對于指導糖尿病腎臟病的診療具有重要意義。