大柴胡湯加減方對濕熱證膽囊膽固醇結石小鼠膽固醇代謝基因SRBI、ABCG5/G8表達的影響

王素英，章小燕，閔 莉*

（1.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；2.福建省中醫健康管理2011 協同創新中心，福建 福州 350122；3.中醫健康狀態辨識研究室，福建 福州 350122）

我國膽結石發病率逐年增多，其中膽囊膽固醇結石（cholesterol gallstones，CS）是臨床最常見的膽囊結石類型，故進一步研究CS 的發病機制對指導其臨床防治意義重大［1-2］。膽結石形成機制復雜且不完善，膽固醇代謝異常致使膽汁內膽固醇過飽和是CS 發生的重要機制之一［3-5］。肝臟主司膽汁分泌，是膽固醇合成、吸收、外排的重要場所。研究發現，血清中高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）可能是致石性膽汁內膽固醇的主要來源；B 類清道夫受體Ⅰ（scavenger receptor class-B typeⅠ，SRBI）是HDL-C 的重要受體，可將其逆轉運至肝臟，促使肝臟分泌的膽汁內膽固醇增多，進而導致CS 的發生［6-8］。三磷酸腺苷結合盒轉運體G5/G8（ATP binding cassette transporter G5/G8，ABCG5/G8）促進肝臟內膽固醇外排入膽囊，是誘發CS 的重要基因［9］。

中醫認為膽石癥常伴濕熱［10］。大柴胡湯源自《傷寒論》，具有清熱祛濕、利膽消石之效，是治療CS 濕熱證的常用藥與代表方［11-12］；現代研究證實大柴胡湯具有保肝、利膽、降脂等作用［13］。大柴胡湯加減方（modified dachaihu decoction，MDD）為2020年膽石癥濕熱證的中醫診療指南中推薦用藥［12］，可調節FXR/FGF15/FGFR4 通路，對CS 濕熱證小鼠起到良好的治療效果［14］。據此，本次實驗擬通過構建CS 濕熱證小鼠模型，從肝臟膽固醇代謝相關基因SRBI、ABCG5/8 的表達差異，進一步探究MMD 治療濕熱型CS 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 C57BL/6J 雄性小鼠24 只，體質量（18±2）g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0004，在福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物實驗室適應性喂養1周，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。本實驗方案通過福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（審批號：FJTCM IACUC 2020071）。

1.2 實驗藥物及飼料 大柴胡湯加減方由柴胡15 g，黃芩10 g，茵陳15 g，郁金15 g，金錢草15 g，茯苓15 g，厚樸10 g，枳實10 g，生大黃6 g 和炙甘草6 g 組成，購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院中藥房。以上中藥水煎煮2 次、濃縮為含生藥1.17 g/mL 的大柴胡湯加減方藥液。熊去氧膽酸膠囊（Losan Pharma GmbH 公司，批號：L20182A）購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院西藥房，將膠囊打開用超純水溶解，配制成濃度為2.5 mg/mL 的熊去氧膽酸溶液。常規飼料由福建中醫藥大學實驗動物中心提供。2%高膽固醇致石飼料（成分：全價飼料粉料82.5%、牛油15%、膽固醇2%、膽酸0.5%，批號：20210107）購自無錫帆泊生物技術有限公司。

1.3 實驗試劑 小鼠總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、磷脂（PL）、HDL 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司，批號：M202101-18、M202101-45、M202101-32、M202110-26）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：J05N11Y130004）；GAPDH 一抗（批號：10015666）、SRBI 一抗（批號：00091630）、鼠二抗（批號：20000261）、兔二抗（批號：20000250）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；ABCG5/G8 一抗（美國Affinity Biosciences 公司，批號：88X7997、41W9164）；逆轉錄試劑盒、SYBR 試劑盒均購自日本TAKARA公司，批號：AK71623A、AK41790A。

1.4 實驗儀器 人工氣候箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）；體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；生物組織包埋機、石蠟切片機（德國Leica 公司）；多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；基因擴增儀、ABI 熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）；化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 動物分組及造模 按照體質量分層隨機分組法將適應性喂養1 周后的雄性小鼠24 只分為空白組、模型組、中藥組和西藥組，每組各6 只。空白組常規飼養；其余3 組小鼠采用“2%高膽固醇致石飼料＋內濕＋外濕”的方法造模13 周，建立CS 濕熱證模型，即造模全周期始終予以2%高膽固醇致石飼料喂養，第10～13 周每天增加10 h 的外部濕熱環境（人工氣候箱設置的溫度31～33 ℃、濕度95%的環境）影響，在處于濕熱環境的同時給予20%蔗糖水。若小鼠出現嗜臥懶動、精神不振、體質量增長減緩、飲食減少、大便質軟、小便短、皮毛油膩稀疏等表現，經解剖后觀察到膽囊結石即可判定為CS 濕熱證造模成功［14］。

2.2 藥物干預 造模成功后，所有小鼠按照體質量0.02 mL/（g·d）計算灌胃量，根據課題組前期研究基礎及體質量等效劑量換算公式［14-16］，中藥組和西藥組小鼠分別給予1.17 g/mL 大柴胡湯加減方藥液和2.5 mg/mL 熊去氧膽酸溶液灌胃，空白組和模型組則予以生理鹽水灌胃，共干預4 周。

2.3 取材 末次干預結束后禁食不禁水12 h，采用摘眼球取血法，收集小鼠血液樣本，離心后取其血清至新的EP 管內并做好標記。隨后將小鼠頸椎脫臼處死、解剖，摘取完整膽囊，并用生理鹽水洗凈后，置于體視顯微鏡下觀察、拍照記錄，隨后保存膽汁。最后摘取小鼠肝左葉，將其切成3 個方塊，1 塊置于4%多聚甲醛固定液中用于后續HE 染色觀察，另外2 塊置于EP 管內凍存于-80 ℃冰箱用于后續mRNA 和蛋白表達量的檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1 小鼠一般情況及膽囊結石觀察 參考課題組前期及他人研究［14，17］，自造模起每周觀察記錄小鼠的精神狀態、活動度、體質量、飲食［18-19］、皮毛、二便等變化情況，造模前后及干預后進行曠場實驗［20-21］，即準備2 個同等規格的白色敞箱（50 cm×50 cm×50 cm，底面被劃分成大小均勻的25 個方格），夜間在黑暗的房間內同時開始2 組小鼠實驗（每組4 名操作者），1 名操作者將小鼠放于敞箱中央，其余3 名操作者不被告知小鼠組別，并分別觀察記錄5 min 內小鼠水平穿越格子數、直立次數和靜止時間，以輔助判斷4 組小鼠濕熱證候。解剖小鼠摘取其完整膽囊，觀察、記錄4 組小鼠膽囊結石情況。

2.4.2 膽汁成分與血清血脂含量測定 參考ELISA試劑盒說明書，設置標準孔、樣品孔與空白孔，依次加入不同濃度的標準品、樣本（膽汁/血清）、蒸餾水各50 μL，除空白孔外，各孔加入HRP 標記的檢測抗體100 μL，37 ℃溫育后重復洗滌5 次，再往所有孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育后，加入終止液50 μL，在450 nm 波長處測定各孔的吸光值（OD 值），計算膽汁中TC、TBA、PL 和血清中TC、HDL 含量。

2.4.3 肝組織病理形態學 將肝組織石蠟標本切片（厚度約4 μm）、采用HE 染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察肝組織病理形態學改變。

2.4.4 qPCR 檢測肝組織中SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平 將肝組織研磨成漿，提取組織內RNA 并測定其純度和濃度。在逆轉錄試劑盒說明書的指導下操作，去除基因組cDNA 并將提取的RNA 逆轉錄為cDNA。根據SYBR 試劑盒的說明，配置反應液與cDNA、所測目的基因引物（PCR 引物及內參由福州瑞真生物技術有限公司設計合成，見表1）混合加樣，依次進行預變性（95 ℃/30 s）、變性（95 ℃/5 s）、退火（60 ℃/30 s），共40 個循環，完成PCR 擴增。以GAPDH 為內參對照，根據各樣本的Ct 值，計算2-ΔΔCt代表SRBI、ABCG5/G8 的mRNA 相對表達量進行后續統計分析。

表1 引物序列

2.4.5 Western blot 檢測肝組織SRBI、ABCG5/G8 蛋白表達量 提取小鼠肝臟組織總蛋白并用BCA 法檢測濃度，配置10%PAGE 凝膠，往泳道內依次加入Marker 和4 組蛋白樣品、電泳（濃縮膠30 V/30 min，分離膠90 V/90 min）后將蛋白條帶轉至PVDF 膜上（250 mA/60 min），再分別經GAPDH、SRBI、ABCG5、ABCG8 一抗（1∶10 000、1∶800、1∶3 000、1∶3 000）4 ℃孵育過夜，洗滌后鼠、兔二抗（1∶5 000）孵育2 h，清洗干凈在ECL 避光條件下顯影、成像，以條帶上SRBI、ABCG5/G8 蛋白的灰度值/GAPDH 蛋白的灰度值，代表相應4 組SRBI、ABCG5/G8 蛋白相對表達量進行后續統計分析。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.00 軟件對數據進行分析，GraphPad Prism 8 軟件進行數據圖片繪制。計量資料符合正態分布以（±s）表示，2 組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 4組小鼠一般情況比較 空白組在整個造模與干預期間，精神狀態良好，好攀爬、較為活躍，平均飲食攝入量穩定，體質量逐步增長，二便正常，皮毛柔順無缺損。造模的3 組在造模1～9 周時，精神狀態尚好，少在籠內走動、好聚堆，飲食量和體質量增長均明顯高于空白組小鼠，皮毛油膩成綹，大便質軟；在造模10～13 周時，3 組陸續出現精神萎靡、嗜臥懶動，常聚堆于角落或藏匿于墊料下方，飲食量明顯減少，體質量下降，眵多，皮毛油膩稀疏且常因啃咬而出現皮毛塊狀缺損，小便色深黃味重，大便稀軟常不成形，表現出明顯的濕熱證候。干預后，中藥組精神狀態有所改善，常在籠內走動、活動度增高，飲食量和體質量增長有所恢復，小便淡黃，大便成形，皮毛柔順完整、眵少，濕熱證候明顯改善；模型組與西藥組無明顯變化。見圖1。

圖1 4 組小鼠一般情況比較

3.2 4 組小鼠膽囊結石情況比較 空白組膽囊體積適中，膽汁淡黃清澈、透光度高、無雜質。與空白組相比，模型組膽囊內肉眼可見沙粒樣結石沉淀，膽汁顏色變深呈棕褐色，膽囊體積增大。中藥組和西藥組膽囊體積較空白組均增大，膽汁顏色較深；與模型組比較，中藥組和西藥組膽囊內結石消失，膽汁渾濁程度降低，以中藥組小鼠膽汁透明度更高。見圖2。

圖2 4 組小鼠膽囊結石情況

3.3 4組小鼠膽汁TC、TBA、PL含量比較 見表2。

表2 4 組小鼠膽汁TC、TBA、PL 含量比較（±s）

表2 4 組小鼠膽汁TC、TBA、PL 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05。

組別空白組模型組中藥組西藥組n 6 6 6 6 TC/（mmol/L）4.81±0.39 9.41±0.371）6.67±0.362）7.57±0.832）TBA/（μmol/L）19.62±0.45 12.86±1.251）16.72±0.722）15.86±0.982）PL/（ng/mL）194.56±8.31 104.68±13.921）164.39±13.492）3）144.19±14.722）

3.4 4組小鼠血清HDL-C、TC 含量比較 見表3。

表3 4 組小鼠血清中HDL-C、TC 含量比較（±s）

表3 4 組小鼠血清中HDL-C、TC 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

TC/（mmol/L）2.00±0.32 7.23±0.201）5.22±0.472）6.19±1.122）組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 HDL-C/（μmol/L）169.80±2.43 122.16±6.181）146.45±2.612）141.83±7.712）

3.5 4組小鼠肝組織病理學形態 空白組肝細胞形態結構正常，細胞核大而居中，細胞間排列緊密、有序；模型組肝細胞腫脹變形，胞質內充斥大量的脂滴空泡，細胞核多被擠至細胞邊緣，細胞間排列松散、混亂；中藥組、西藥組肝細胞內脂滴空泡明顯減少、變小，肝組織脂肪樣變性明顯減輕，細胞間排列相對清楚，其中中藥組肝臟組織形態更趨近于正常組。見圖3。

圖3 4 組小鼠肝臟組織形態（HE 染色，×200）

3.6 4組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA 表達水平比較 見表4。

表4 4 組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平比較（±s）

表4 4 組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ABCG8 1.01±0.02 2.18±0.101）1.50±0.442）1.93±0.38組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 SRBI 1.03±0.04 2.25±0.401）1.37±0.162）1.47±0.202）ABCG5 1.05±0.04 2.19±0.041）1.53±0.46 1.95±0.13

3.7 4組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 蛋白表達量比較 見圖4、表5。

圖4 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8 蛋白條帶圖

表5 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8蛋白表達量比較（±s）

表5 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ABCG8 0.18±0.05 0.41±0.022）0.30±0.032）0.24±0.022）組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 SRBI 0.29±0.02 0.52±0.191）0.40±0.07 0.49±0.08 ABCG5 0.10±0.04 0.24±0.12 0.21±0.13 0.23±0.10

4 討 論

CS 屬中醫學“膽脹”“脅痛”“黃疸”等范疇，因濕熱、痰瘀、氣郁、蟲毒、陰虛等多種病理因素相互作用、影響，膽汁排泌不暢，而日久淤滯成石。研究發現，濕熱壅滯乃膽石癥關鍵病機及臨床常見證型［22-23］；故采用清熱祛濕、利膽消石之法為主對CS進行治療，臨床亦常用大柴胡湯為基礎方隨癥加減治療CS 濕熱證且療效頗佳［24-26］。本次研究選用的大柴胡湯加減方源自膽石癥濕熱證中醫診療指南推薦用藥［12］，在原方的基礎上，去半夏、白芍與姜棗，加郁金與柴胡共解肝膽之郁，配以茵陳、黃芩清利少陽、陽明之濕熱；厚樸與枳實相配，可強化燥濕行氣之效；輕用生大黃泄陽明壅滯之濕熱，重用金錢草加強清熱祛濕、利膽消石之效；茯苓利水濕、健脾胃，與炙甘草共為佐藥，可調和諸藥。全方以攻為主，滌壅滯之濕熱，疏肝膽之淤，又注意顧護脾胃，是清熱祛濕、利膽消石之佳劑。

現代醫學研究發現，膽汁中膽固醇過飽和是CS 發生的關鍵機制，也是其突出的病理表現［3-5］。膽汁中的成分主要有TC、TBA、PL，若膽汁成分比例異常，即TC 增多或TBA、PL 比例降低均會導致膽汁中膽固醇過飽和析出形成CS［5，27-28］。經臨床及動物實驗發現，CS 患者/小鼠血脂成分異常，血清中TC 含量異常升高而HDL-C 含量則明顯降低［29-30］。TC 的血清濃度可反映機體脂代謝情況，與飲食關系密切；HDL-C 與SRBI 特異性結合逆轉運膽固醇至肝臟被認為是CS 患者膽汁中膽固醇的主要來源［6-7，31］。ABCG5/G8 參與轉運肝臟內膽固醇至膽囊，與CS 的發生、發展密切相關［9］。肝臟是膽固醇代謝的重要器官，若脂質代謝異常，肝臟組織形態則可能發生異常。本次實驗中，模型組小鼠肝臟脂肪變性明顯，膽汁中TC 含量顯著增多、TBA和PL 含量顯著下降，血清TC 含量升高、HDL-C 則顯著降低，且肝臟中SRBI、ABCG5、ABCG8 mRNA與蛋白表達均有上調趨勢，與上述研究報道一致。

薛生白曰：“內外相引，故病濕熱”，故本次實驗在濕熱模型制備時，兼顧了內外濕熱因素的影響。造模的小鼠長期食用2%高膽固醇致石飼料，屬膏粱厚味，滋膩滯礙脾胃，使其運化無權，而生濕熱；同時，高膽固醇高脂飲食是誘發CS 的重要危險因素［32］，通過長期飲食因素的干擾，既保證了CS 模型的建立又促使濕熱內生。康潔和高碧珍［33］認為塑造病證結合動物模型，應該先確保“病”已形成后，再建立“證”模型，如此病癥模型才會穩固。根據課題組前期研究結果，高膽固醇致石飼料喂養小鼠9周便可形成CS［15，34］。故本次實驗在造模10～13周增加外部濕熱環境因素的干擾，同時給予小鼠20%糖水進一步增加內濕因素的影響。結果顯示，模型組小鼠膽囊內出現肉眼可見的沙粒樣結石沉淀，膽汁顏色變深、膽囊體積增大，即CS 模型建立成功。現階段關于動物濕熱證模型的評價尚無統一的規范化標準，所以本次研究中，以中醫學在臨床中人的濕熱證候表現為參照，來評判動物濕熱證模型建立是否成功。在造模10～13 周，造模的3 組小鼠均表現出精神萎靡，嗜臥懶動，飲食減少，體質量增長遲緩，小便黃赤，大便稀軟，面垢眵多，皮毛油膩稀疏等表現，與《脾胃論》中記載的濕熱證候表現“人感之多四肢困倦，精神短少，懶于動作，胸滿氣促，肢節沉疼……小便黃而數，大便溏而頻……不思飲食”高度契合，表明造模的3 組小鼠表現出明顯的濕熱證候。經大柴胡湯加減復方干預后，小鼠的濕熱證候較模型組與西藥組明顯改善。

熊去氧膽酸是臨床治療膽結石的常用藥，具有調節脂質代謝、利膽、消石之效［19，24］。因大柴胡湯加減方亦有上述功效［12-13］，且更添清熱祛濕之用，故通過將中藥組與西藥組治療效果進行比較，可以較為直觀地闡釋大柴胡湯加減方治療CS 的作用機制，并從方證對應的角度進一步驗證CS 模型小鼠的濕熱病理。故實驗結果顯示中藥組小鼠膽汁結石狀況、濕熱證候、肝臟脂肪病變程度、血脂含量、膽汁成分及SRBI、ABCG4/G8的mRNA與蛋白表達情況的改善程度整體上均優于西藥組，且更趨近于空白組。以上差異無統計學意義，可能是由于樣本量較少的緣故。

綜上表明，SRBI、ABCG5/G8 表達異常升高可能是CS 濕熱證的分子生物學機制之一。大柴胡湯加減方能通過抑制SRBI、ABCG5/G8 的表達，調節膽固醇代謝，減少膽固醇過飽和膽汁的分泌，改善肝臟脂肪變性，發揮清熱祛濕、利膽消石的作用，從而達到治療濕熱型膽石癥的效果。