甲磺酸雷沙吉蘭片的生物等效性研究及非酪胺控制飲食條件下對中國健康受試者血壓的影響*

王 茂，趙巧林，劉小英，沈 浩，游雪丹

（1.重慶華森制藥股份有限公司，重慶 401121； 2.軍事醫學科學院生物工程研究所，北京 100850）

帕金森病（PD）是一種慢性、進行性、神經退行性疾病，主要由黑質紋狀體途徑的黑質多巴胺神經元的丟失引起［1-2］，是僅次于阿爾茨海默病的第2 種最常見的與年齡相關的神經退行性疾病，目前影響著全球約2%60 歲以上的人口［3-4］。由于病理復雜，臨床需要更多類型的藥物治療非運動癥狀［5］。甲磺酸雷沙吉蘭是一種新的不可逆的單胺氧化酶B（MAO-B）抑制劑，對單胺氧化酶的B 亞型具有較高選擇性，可改善PD 患者的運動功能障礙，同時也能降低運動并發癥的嚴重程度，目前已在美國、歐盟、日本和中國批準用于治療PD［6-7］。本研究中初步評價了2 種甲磺酸雷沙吉蘭片在空腹和餐后條件下的生物等效性，并探討進食高脂餐后對甲磺酸雷沙吉蘭藥代動力學尤其是在非酪胺攝入控制條件下對中國健康受試者血壓的影響。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：TRIPLE QUAD 4500 型質譜儀（AB Sciex 公司），配有Sciex TurboIonSpray 電噴霧離子源；LC -20ADXR型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

試藥：受試制劑（T）甲磺酸雷沙吉蘭片（重慶華森制藥股份有限公司，批號為191003，規格為1 mg）；參比制劑（R）甲磺酸雷沙吉蘭片（商品名安齊來?，Teva pharmaceutical Industries Ltd.，批號為R89054）；雷沙吉蘭對照品（批號為2807 - 096A1，含量為98.9%），雷沙吉蘭-13C3（內標，批號為2621 - 038A1，含量為97.8%），均購于TLC Pharmaceutical Standards。

2 方法與結果

2.1 研究對象選擇

選取湖北省武漢市傳染病醫院2019年8月至12月的健康受試者24 例，年齡18～65歲；體質量指數（BMI）19.0～26.0 kg/m2，男性體質量不低于50 kg，女性體質量不低于45 kg。首次給藥前1 周內，所有受試者均進行必要的體檢。研究方案由湖北省武漢市傳染病醫院醫學倫理委員會批準（倫理批件號為GCP - I - 2019 -07.02），并根據赫爾辛基宣言和《臨床試驗質量管理規范》（GCP）進行，每位受試者參與試驗前1 周均簽署知情同意書。

2.2 研究設計

本研究為隨機、開放、兩制劑、單劑量、兩周期、兩序列、雙交叉的空腹和餐后生物等效性試驗，清洗期7 d，受試者按1∶1區組隨機被分配到1種給藥序列。研究期間，受試者在給藥前1 d 入住臨床中心。空腹組受試者給藥前至少禁食10 h，餐后組受試者被要求在給藥前30 min內進食不控制酪胺攝入的高脂餐。每個研究周期中，以受試制劑或參比制劑的形式給藥1 片（1 mg），第1 天8：00給藥，用240 mL溫水吞服，隨后進行密集的采血和血壓監測。用藥后2 h 內禁飲；第1 天給藥后4 h 和10 h提供標準午餐和晚餐。第2 周期第2 天，進行生命體征檢查、12導聯心電圖、體格檢查及實驗室常規檢查，出院。

分別于給藥前0 h（服藥前1 h 內）及給藥后5，10，15，20，30，40，50 min及1，1.25，1.5，2，4，6，8，10 h時采血。血漿離心（1 000g，25 ℃）15 min，- 90～-60 ℃冷凍保存，直至運送到檢測機構，采用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法分析。采用Analyst 1.6.3軟件（AB Sciex公司）進行數據采集和分析。

采用Phoenix WinNonlin 8.1 軟件進行藥代動力學參數計算和生物等效性分析，預定的生物等效性判定區間為80.00%～125.00%。

通過臨床評估、生命體征、體格檢查、實驗室分析和不良事件（AE）確定安全性。此外，分別于服藥前1 h內及服藥后（1.0 ± 0.5）h、（4.0 ± 0.5）h 測量受試者坐位生命體征（包括體溫、脈搏及血壓），同時在給藥后（15±3）min、（30±3）min、（45±3）min加測受試者的坐位血壓。

2.3 測定方法與血樣處理

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Venusil C18Plus 柱（2.1 mm × 50.0 mm，5.0 μm）；流動相A（MPA）：含10 mmol/L甲酸銨的水溶液；流動相B（MPB）：含0.01%甲酸的乙腈溶液；流速：1.00 mL/min；進樣量：20.0 μL；自動進樣器溫度：4 ℃；柱溫箱溫度：35 ℃。

2.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；正離子模式；多反應監測掃描方式；電噴霧電壓：5 500 V；渦旋離子噴霧溫度：600 ℃；氣簾氣：40 psi；霧化氣：60 psi；輔助氣：60 psi；碰撞氣：9 unit；用于定量分析的監測離子分別為質荷比（m/ z）172.1 →117.1（雷沙吉蘭）和m/ z175.1 →117.1（雷沙吉蘭-13C3）。

2.3.3 樣品處理

采用蛋白沉淀法從人血漿中提取雷沙吉蘭，稀釋提取過的樣品，按上述色譜與質譜條件進樣分析，線性范圍為15.0～15 000 pg/ mL，已超過文獻［7 - 8］所報道的檢測限范圍。取標準品適量，溶于甲醇，制備雷沙吉蘭標準溶液和QC溶液。取人血漿樣品100 μL，加入內標工作液（質量濃度為5.00 ng/mL）25 μL，加入400 μL乙腈蛋白沉淀，渦旋5 min，離心（1 700g，4 ℃）15 min。取200 μL 上清液，置加有100 μL R0工作溶液［甲醇-水（50∶50，V/V）］的96 孔深孔板中，渦旋5 min，按上述色譜與質譜條件進樣分析。同時，采用生物樣品再分析（ISR）法評價重復性。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別采用至少6 個不同供體/來源空白正常基質樣品、至少1個來源空白高脂基質和至少1個來源空白溶血基質、混合來源的空白基質樣品和空白試劑溶液配制定量下限（LLOQ）質控樣品，處理后進行HPLC - MS/ MS 法分析，不同來源的空白基質中在分析物保留時間處的干擾峰響應不超過相同來源的空白基質配得的LLOQ 質控樣品中分析物響應的20%；于內標保留時間處的干擾峰響應不超過相同來源的空白基質配得的LLOQ 質控樣品中內標響應的5%。混合來源的空白基質樣品和空白試劑樣品在分析物保留時間處的干擾峰響應不超過LLOQ 樣品中分析物響應的20%；于內標保留時間處的干擾峰響應不超過零濃度樣品中內標響應的5%。結果表明，血漿中內源性物質對待測物的測定無干擾，方法專屬性良好。

靈敏度試驗：通過測定標準曲線的LLOQ 樣品中分析物的儀器響應與空白基質樣品中分析物保留時間處儀器的信噪比（S/N）來確定分析方法的靈敏度。分析物的S/N＞5。色譜圖見圖1。

A.雷沙吉蘭 B.雷沙吉蘭- 13C3圖1 定量下限濃度樣品（靈敏度）的代表性高效液相色譜串聯質譜圖A.Rasagiline B.Rasagiline - 13C3Fig.1 A representative HPLC - MS / MS chromatograms of the lower limit concentration（sensitivity）sample

準確度和精密度試驗：配制質量濃度為15.0，45.0，700，4 500，11 100 pg/mL的質控樣品，在至少3個準確度和精密度的分析批中，各質量濃度質控樣品均配制6個平行樣品。分別計算各質量濃度質控樣品的批內和批間的準確度偏差和精密度，評價分析方法的準確度和精密度。各質量濃度質控樣品的批內與批間的平均準確度偏差應不超過±15%（LLOQ 質控樣品應不超過± 20%），RSD不超過15%（LLOQ 質控樣品應不超過20%），每個濃度至少5個有效值。結果平均準確度偏差（與標示濃度偏差）范圍為-0.7%～2.0%，RSD最大值為11.1%（范圍1.9%～11.1%）。

回收試驗：采用混合空白基質配制的低、中、高質量濃度質控樣品提取后的分析物或內標響應與在混合空白基質中提取后分別加入低、中、高質量濃度的質控樣品純溶液中分析物或內標的響應比較來評價。每個質量濃度的6 個平行樣的RSD不超過15%，至少5 個有效值。各質量濃度質控樣品的各自平均回收率不應出現與質量濃度相關的趨勢，各濃度質控樣品的回收率的RSD不應超過30%。計算出低、中、高質量濃度的含藥血漿中雷沙吉蘭的提取回收率分別為109.4%，102.3%，103.6%（n= 6），內標萃取回收率為100.9%（n=18）。

基質效應：分別采用至少6個不同來源的空白正常基質，至少1 個來源空白高脂基質和至少1 個來源空白溶血基質處理樣品，加入高濃度和低濃度的分析物和內標，配制基質效應評價樣品（MER），同時配制不含基質提取物的同濃度純溶液對照樣品（MEP），通過計算各樣品中的內標歸一化的基質因子，評價基質效應對分析物準確定量分析的影響。所有不同來源基質中內標歸一化的基質因子的RSD不超過15%，表明基質效應對分析物準確定量分析的影響可忽略。結果高、低質量濃度的內標歸一化的基質因子分別為0.994±0.012 7和0.989±0.047 6，RSD≤4.8%。

基質樣品中分析物的穩定性：采用6 個平行樣低、高質量濃度的質控樣品，分別于-20 ℃和-80 ℃條件下5 次凍融后穩定，室溫放置16 h 穩定，于-20 ℃條件下12 d穩定，于-80 ℃條件下79 d穩定。

2.5 生物等效性評價

2.5.1 藥代動力學參數與統計學處理

采用SAS 9.4 軟件構建個體血藥濃度-時間曲線，根據血藥濃度-時間實測數據計算達峰濃度（Cmax）和達峰時間（tmax）；采用最小二乘線性回歸估計腎排泄速率常數（ke），并按公式計算終末消除半衰期（t1/2），計算公式為t1/2=ln2/ke；采用梯形法則估算0-t時血藥濃度時間曲線下面積（AUC0-t）；按公式計算0-∞時血藥濃度時間曲線下面積（AUC0-∞）、表觀總清除率（CL/F）、表觀總分布體積（Vz/F），計算公式分別為AUC0-∞=AUC0-t+（Ct/ke），CL/F=給藥劑量/AUC0-∞，Vz/F=CL/F/ke。為評價參比制劑與受試制劑的生物等效性，以藥代動力學參數Cmax，AUC0-t，AUC0-∞為主要變量。在5%顯著性水平（α= 0.05）下，以上述參數的對數轉換數據進行2×2 交叉設計的方差分析。為評估生物等效性，利用對數轉換數據計算上述參數的幾何均值比（GMR）的點估計值的90%置信區間（90%CI），超過接受限度（80.00%～125.00%）的概率由Schuirmann 描述的2 個單側t檢驗確定。采用Phoenix WinNonlin 8.1 軟件進行藥代動力學參數計算和分析。

2.5.2 試驗安全性評價

安全性評價通過收集試驗期間的AE、體格檢查、臨床實驗室檢查、12 導聯心電圖和生命體征（血壓、心率和額溫）來確定。受試者被要求在研究期間的任何時間自發地向研究人員報告任何AE，包括清洗期。所有AE均使用MedDRA 22.0進行編碼。

為探討非酪胺控制的飲食對健康人血壓的影響，在空腹和餐后狀態下，給藥后4 h內，包括給藥前1 h內、給藥后（15±3）min、（30±3）min、（45±3）min、（1.0±0.5）h、（4.0±0.5）h，集中監測全部受試者的上臂血壓。

2.5.3 人口統計學特征比較

共有24例受試者，其中空腹組12例，餐后組12例。空腹組在第1 周期結束后有1 例受試者因皮疹和疲勞退出試驗。餐后組在研究過程中無受試者退出。24 例受試者人口學特征比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 24例受試者人口學特征Tab.1 Demographic characteristics of 24 volunteers

2.5.4 藥代動力學參數比較

空腹組：雷沙吉蘭給藥后平均血藥濃度- 時間曲線見圖2 A，雷沙吉蘭給藥后平均血藥濃度-時間半對數曲線見圖3 A，雷沙吉蘭的藥代動力學參數見表2。可見，受試制劑與參比制劑的血藥濃度- 時間無顯著差異，呈半對數曲線。對Cmax進行方差分析，結果顯示，無顯著的周期效應、藥物效應和序列效應。對AUC0-t和AUC0-∞的方差分析結果顯示，AUC0-t存在顯著的周期效應（P＜0.05），而藥物和序列效應不顯著。整體生物等效性分析產生了對數轉換的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞的平均比率和90%CI。Cmax為73.13%～138.23%，AUC0-t為90.73%～119.50%，AUC0-∞為89.99%～118.70%。結果顯示，Cmax未達到預先設定的生物等效性范圍（80.00%～125.00%），AUC0-t和AUC0-∞均在預先設定的生物等效性范圍內。受試者個體內Cmax，AUC0-t，AUC0-∞的變異系數（CV）分別為43.44%，17.87%，17.96%，表明受試者Cmax個體內變異較高。

表2 單次給藥后中國健康受試者藥代動力學參數（PKPS）Tab.2 Pharmacokinetic parameter（PKPS）in Chinese healthy volunteers after single dose

A.空腹 B.餐后圖2 給藥后平均血藥濃度-時間曲線A.Fasting state B.Postprandial stateFig.2 Mean plasma concentration - time curves after medication

餐后組：給藥后的平均血藥濃度-時間曲線見圖2 B，雷沙吉蘭給藥后的平均血藥濃度-時間半對數曲線見圖3 B，雷沙吉蘭的藥代動力學參數見表2。對Cmax進行方差分析，結果顯示，無顯著的周期效應、藥物效應和序列效應。對AUC0-t和AUC0-∞的方差分析結果顯示，AUC0-t存在顯著的周期效應（P＜0.05），藥物效應和序列效應不顯著。整體生物等效性分析產生了對數轉換的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞的平均比率和90%CI。Cmax為96.96%～162.15%，AUC0-t為 102.90%～133.59%，AUC0-∞為102.41%～135.37%。結果顯示，Cmax未達到預先設定的生物等效性范圍（80.00%～125.00%），AUC0-t和AUC0-∞也未在預先設定的生物等效性范圍內。Cmax，AUC0-t，AUC0-∞受 試 者 個 體 內CV分 別 為35.82%，17.77%，17.55%，表明餐后組受試者Cmax個體內變異較高。

2.6 非酪胺控制的飲食對血壓的影響

受試制劑（T）甲磺酸雷沙吉蘭片尚未獲準上市，且是否與參比制劑（R）等效并不確定，故此處僅提供參比制劑的血壓監測數據，確保真實地反映甲磺酸雷沙吉蘭片對中國健康受試者血壓的影響。空腹組和餐后組給藥前后的平均收縮壓/舒張壓-時間曲線見圖4。結果顯示，空腹組和餐后組的收縮壓和舒張壓變化無顯著差異（P＞0.05）；餐后組收縮壓的整體上升趨勢比空腹組略明顯，但無論空腹還是餐后受試者波動后升高的血壓均在正常范圍內，舒張壓在空腹組和餐后組均呈現下降趨勢。表明在不控制酪胺攝入（高脂餐設計未控制酪胺攝入）的情況下，藥物對血壓的影響有限。

A - B.平均收縮壓- 時間曲線（空腹、餐后）C - D.平均舒張壓- 時間曲線（空腹、餐后）圖4 給藥前后平均收縮壓/舒張壓-時間曲線A - B.Mean systolic blood pressure - time curves（fasting and postprandial state） C - D.Mean diastolic blood pressure - time curves（fasting and postprandial state）Fig.4 Mean systolic / diastolic blood pressure - time curve before and after medication

2.7 安全性評價

9例受試者共報告14例次AE，詳見表3。其中，8例次發生在受試制劑給藥后，4 例次發生在參比制劑給藥后。最常見的是貧血（4例次）和血尿酸升高（2例次）。所有AE 均被認為是輕微的，可能與研究治療有關。所報道的AE 強度較輕，研究期間未發生急性過敏反應和死亡。空腹組1 例受試者因貧血和皮疹退出研究。在無藥物或其他治療的情況下，所有AE 均消失或緩解。因此，在中國健康受試者中，受試制劑和參比制劑均是安全的，耐受性良好。

表3 24例中國健康受試者單次給藥1 mg后的不良事件Tab.3 Adverse events after a single dose of 1 mg in 24 Chinese healthy volunteers

3 討論

本研究中首次探討了非酪胺控制的飲食對中國健康受試者血壓的影響，同時總結了中國健康受試者在空腹和餐后不同條件下服用甲磺酸雷沙吉蘭片后個體內變異（CV）的情況。

在評估食物對雷沙吉蘭藥代動力學的影響時，發現餐后條件下Cmax降低、tmax延長。結果表明，2種條件下雷沙吉蘭的吸收速率都很快，但食物會影響雷沙吉蘭的系統暴露和吸收達峰。Cmax和tmax具有顯著差異，可能是由于食物造成的胃排空延遲，尤其是在餐后研究中服用的高脂肪飲食。但在雷沙吉蘭（安齊來?）的中文藥品說明書中關于“雖然與高脂食物同服時Cmax和血漿暴露（AUC）分別下降約60%和20%，但食物不影響雷沙吉蘭的tmax”的描述與本研究結果有所不同，但文獻［9］的描述與本研究結果一致。

所有受試者的AUC_%Extrap均小于20%，表明采血時間足夠長。空腹組和餐后組受試者個體內Cmax的CV%43.44%和35.82%，這與文獻［10］的研究結果一致，表明雷沙吉蘭是存在一定個體內變異的藥物。雷沙吉蘭在中國人群中的個體內變異高于報道人群，可能是由于雷沙吉蘭的代謝途徑的人種差異和飲食習慣差異造成的，包括細胞色素P450酶系統的作用（CYP1A2是主要的代謝酶）。KALL等［11］報道，CYP1A2活性受飲食影響較大。另據報道，人種差異也是存在的，CYP1A2活性瑞典人比韓國人高1.54倍，亞洲和非洲人口比白種人低［12］。

研究結果也表明，藥代動力學參數AUC0-t和AUC0-∞幾何均值比僅空腹組在預定的生物等效性范圍內（80%～125%），而Cmax均不在預定的生物等效性范圍內，很可能與Cmax的受試者個體內高變異性和制劑本身差異有關。

本研究中14例次AE都不嚴重。受試制劑與參比制劑的AE 發生率無顯著差異；不可能存在AE 的潛在偏倚。試驗期間受試者都在臨床中心接受醫療監管，且清洗期僅為1 周。受試制劑和參比制劑均安全，耐受性良好。

在臨床推薦使用的劑量下服用雷沙吉蘭且不控制飲食中酪胺的攝入的情況下是安全的，但某些研究者和倫理委員會成員仍對早期藥品包裝說明書中標明的酪胺飲食注意事項表示安全擔憂，且在本品的藥品說明書中一直缺乏中國人群單次服藥后的原始血壓監測數據。本研究中專門監測中國健康受試者人群的血壓變化，以期為臨床運用提供參考。

酪胺是一種高濃度的氨基酸，存在于陳年奶酪、發酵肉類、酸菜等食物中，食物中的酪胺吸收入人體后可刺激腎上腺素能神經末梢釋放神經遞質的活性，經單胺氧化酶A（MAO-A）代謝后失活。食用富含酪胺的食物時，如同時使用某些單胺氧化酶抑制劑（MAOI），吸收的大量酪胺不能及時被MAO 代謝，可導致高血壓危象，即酪胺反應，出現血壓急劇升高、心動過速、皮膚潮紅、頭痛、嘔吐等癥狀，嚴重時可并發腦出血，甚至危及生命。因此，非選擇性MAOI的治療性使用已受到限制，需限制飲食中酪胺的攝入，以避免潛在的嚴重高血壓反應。腸道中90%的MAO 活性涉及MAO - A［13］，選擇性MAO - B 抑制劑雷沙吉蘭不受這一限制，在這些相互作用研究中，酪胺樣反應通常發生在1 h 內［14］。故本研究中設計的監測血壓的時間為至給藥后4 h，結果顯示，在中國健康受試者中，空腹組和餐后組間的收縮壓和舒張壓無顯著差異。然而，值得注意的是，本研究中樣本量不夠大，尚缺乏統計學意義，但并不一定無影響。雷沙吉蘭給藥后，餐后血壓與空腹血壓存在差異。參比制劑的藥品說明書中提示，存在高血壓和體位性低血壓不良反應，應加強對用藥人群血壓的監測。

本研究的不足之處在于，樣本量小，數據有限，可能存在一定的理論局限性。首先，雷沙吉蘭個體內高變異性，樣本量較小。另外，健康受試者接受單劑量治療，而雷沙吉蘭的藥代動力學參數在其他目標患者中可能不同，與單劑量治療相比目標患者長期服用藥物可能出現藥物蓄積。

綜上所述，在空腹和餐后給藥條件下，甲磺酸雷沙吉蘭片受試制劑單次口服給藥后的藥代動力學與參比制劑具有可比性；食物顯著改變雷沙吉蘭的全身暴露量，同時會延緩雷沙吉蘭的全身吸收；在中國人群中，雷沙吉蘭是一種具有一定個體內變異性的藥物，需要更大的樣本量來驗證生物等效性；中國健康受試者進食非酪胺控制的飲食后服藥對血壓的影響不顯著；參比制劑和受試制劑都具有良好的安全性。