噬菌體展示庫篩選冠狀病毒刺突蛋白抗體*

范能全，張 玲，鐘亞東，嚴大軍，王 琳，彭 蘭

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.重慶市中藥研究院，重慶 400060； 3.重慶圣華曦藥業股份有限公司，重慶 401336； 4.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000； 5.重慶醫藥高等?？茖W校，重慶 401331）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的結構主要有單股正鏈核酸（ssRNA）、刺突蛋白（簡稱S蛋白）、膜蛋白、包膜蛋白、核衣殼蛋白（簡稱N 蛋白）。S 蛋白形成三聚體結構，可識別并結合宿主細胞表面的受體，誘導機體產生中和抗體，在病毒感染的第一步發揮重要作用［1-2］。目前，已研發多個病毒抗體，對其Fc 片段進行修飾和改造，用于單株抗體或多株抗體治療。對于冠狀病毒的急性感染及預防，需利用抗體治療配合人體的免疫，阻斷病毒復制，防止病情惡化。已知抗體對于快速突變的病毒靶點具有局限性［3-7］，如何高效、快速地產生多種針對不同病毒突變形式的抗體是研究的重點。本研究中對比了各種冠狀病毒S 蛋白的保守區域，合成蛋白抗原，通過對小鼠免疫，制備了針對冠狀病毒的抗體scfv 展示庫，篩選出了COVID - 19 特異性抗體，建立了冠狀病毒抗體篩選方法，為進一步修飾和改造抗原片段、篩選冠狀病毒感染抗體提供參考?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：T100 型PCR 儀，ChemiDoc?Touch 型凝膠成像儀，1652660 型Gene Pulser Xcell 電穿孔儀，均購于美國Bio-Rad 公司；Legend Micro21R 型超速離心機，Varioskan Flash 型多功能酶標儀，均購于美國Thermo 公司；AKTA pure25 型蛋白純化儀（美國通用公司）；K5600/ C 型微量分光光度儀（北京凱奧科技有限公司）；G26 - SN48 型全自動電泳系統（INTERLAB CO.，LTD.）；TE77XP 型蛋白電轉儀（美國Hoefer 公司）；JY-JX5型電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；INCO153型細胞恒溫培養箱（德國Memmert公司）。

試藥：PET-22克隆載體（英國Novegen 公司，批號為220507101）；冠狀病毒保守蛋白結構域cDNA 合成片段（上海生工生物工程技術服務有限公司，批號為2203040541）；大腸桿菌BL21 感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司，批號為83041021）；異丙基硫代-β-D- 半乳糖苷（IPTG，批號為623045），Tris（批號為524896），Tryptone（批號為632510），均購于美國Sigma公司；Yeast Extract（BBI 生命科學有限公司，批號為202205162034）；6×His Ni 親和層析預裝柱（美國Cytiva公司）；預染Marker（批號為2807315），大腸桿菌菌株TG1（批號為2445872），輔助噬菌體顆粒VCM13（批號為2752874），質粒pComb3XSS（批號為2325681），Trizol試劑（批號為2235698），蛋白預制膠（批號為2145671），均購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；cDNA 合成試劑盒（Invitrogen 細胞，批號為2589741）；聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（日本Takara Bio 公司，批號為2145893）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號為22060501），聚乙二醇（PEG）溶液（批號為22100607），均購于北京索萊寶科技有限公司。

動物：BALB/c 雌性小鼠，6 周齡，購于北京斯貝福有限公司，動物生產合格證號為110324230100220937，動物生產許可證號為SCXK（京）2019 - 0010。飼養于SPF 環境中，飼養設施符合SPF 實驗動物的飼養要求，動物使用許可證號為SYXK（渝）2020-0002。

1.2 方法

1.2.1 冠狀病毒S 蛋白體外表達

根據冠狀病毒S蛋白家族數據庫，合成保守序列，分子克隆連接到pet-22原核表達載體。IPTG 誘導重組質粒融合蛋白表達：1）按1∶100 接種于5 mL LB（Kana+）培養液中，振搖（溫度為37 ℃，轉速為220 r/min）至菌體在600 nm 波長處的吸光度（OD600）為0.6～0.8。2）取出1 mL菌液作為未誘導菌液，在剩余菌液中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，振搖（溫度為37 ℃，轉速為150 r/min）20 h，誘導融合蛋白表達。3）未誘導菌液室溫離心（轉速為10 000 r/ min）1 min，棄上清液，用300 μL PBS 重懸菌體沉淀。4）取出1 mL 誘導菌液，室溫離心（轉速為10 000 r/min）1 min，棄上清液，用300 μL 1×PBS重懸菌體沉淀。剩余誘導菌液離心（轉速為10 000 r / min）1 min，棄上清液，用1 mL 1 × PBS 重懸菌體沉淀；重懸液進行超聲波破碎，分別取上清液與沉淀液加入1 ×PBS重懸。5）進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測分析，考馬斯亮藍染色顯帶。

1.2.2 重組蛋白的6×His Ni 柱親和純化

1）準備1 mL 填料柱子，置4 ℃展示柜中操作。2）用3～5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液，使用10倍柱體積的Lysis buffer（8 mol/L 尿素- PBS）平衡柱子。3）上樣，孵育5 min，用容器收集流穿液。4）用10 倍柱體積的Lysis buffer平衡1次柱子，再上樣1遍。5）待上樣結束后，加入20 倍柱體積包涵體Wash buffer（50 mmol/L咪唑- PBS - 8 mol/L 尿素）洗柱子，用5 mL 離心管收集洗脫液。6）除雜結束后用5倍柱體積不同咪唑濃度分別為100，250，500 mmol/L 咪唑- PBS- 8 mol/L 尿素的包涵體Elution Buffe 洗脫柱子，用5 mL離心管收集洗脫液，再加入10 倍柱體積的Elution buffer 洗脫，收集洗脫液。7）進行12%SDS-PAGE分析。

1.2.3 細胞培養

人293T 細胞系培養于DMEM 高糖培養基（含有10%胎牛血清和1%雙抗），以及37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。

1.2.4 脾臟總RNA 提取

將脾臟用剪刀剪碎，切成50 mg 碎片，置含1.5 mL RNase free的EP管中，并加入1 mL Trizol試劑，勻漿；在上述樣品中加入200 μL三氯甲烷，上下顛倒混勻，室溫靜置5 min，離心（溫度為4 ℃，轉速為12 000 r/min）15 min；將上清液轉移至含RNase free 的EP 管中，加入500 μL異丙醇，顛倒數次后放置10 min，離心10 min；倒掉上清液，加入1 mL焦磷酸二乙酯（DEPC）水配置的75%乙醇洗滌沉淀，離心（溫度為4 ℃，轉速為12 000 r / min）5 min；吸除上清液，室溫晾干，加入30～60 μL DEPC 水溶解RNA，測定RNA濃度和純度。

1.2.5 抗體展示庫構建

用invitrogen first strand 試劑盒合成cDNA：參考文獻［8］，引物合成小鼠抗體輕鏈和重鏈可變區VL和VH，采用overlap PCR 以12氨基酸接頭GGGGSGGGGSGG 將VL和VH連成1條基因片段；選用Sfi1限制性內切酶，將獲得的基因片段克隆入pComb3XSS載體；用電轉儀重組質粒，轉入大腸桿菌TG1 感受態細胞；擴大培養TG1 細胞，利用M13輔助VCM13噬菌體感染TG1大腸桿菌，感染后用PEG沉淀噬菌體顆粒，溶于BSA溶液中，待用。

VH 和VL PCR 擴增體系：5 μL ExTaq DNA polymerase，0.5 U dNTP mixture，0.25 mmol/ eachprimers，10 nmol/each ultrawater至50 μL。

重疊延伸PCR體系：VH產物100 ng，VL產物100 ng，各種引物10 nmol/ each 10 × buffer，5 μL ExTaq DNA polymerase，0.5 U dNTP mixture，0.25 mmol/ each ultrawater 至50 μL。

Mouse VL forward primers：MVL - F1 為5 - cggcatttcgtcGAATTCcGAYATTGTDHTVWCHCAGTC - 3，MVL-F2為5-cggcatttcgtcGAATTCcGAYATTNWKMTVAHDCAGTC - 3，MVL - F3 為5 - cggcatttcgtc-GAATTCcGAYRTYBWRMTSACMCARWC - 3，MVL -F4 為5 - cggcatttcgtcGAATTCcGAYATYSWGMTGACNC ARBC - 3，MVL - F5 為5 - cggcatttcgtcGAATTCcGAY RYTGTKRTRMYYMRGDW-3。

Mouse VL reverse primers：MVL - R1 為5 - tcctcctgagccgccgccgccagaaccaccaccaccCCGTTYNAKYTCCA -RCTTDG - 3，MVL - R2 為5 - tcctcctgagccgccgccgccagaaccaccaccaccMCSTWBNABHKYCAVYYTDG-3。

Mouse VH forward primers：MVH-F1 為5-ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaSAKGTBMAGCTBMAG -SASTC - 3，MVH - F2 為5 - ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaSAGGTYCARCTBCARCARTC - 3，MVH -F3 為5 - ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaSAVGTS MWSBTGRWGSARTC - 3，MVH - F4 為5 - ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaGAKGTGMAVSKGRTG -GAR TC-3，MVH-F5 為5-ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaGARGTRMARSTTSWBGAGTC - 3，MVH -F6 為5 - ggtggtggtggttctggcggcggcggctcaggaggaSAKGTBMMNYTVVWVSWRYS-3。

Mouse VH reverse primers：MVH-R1為5-ttctatgcgcAAGCTTttaYGARGARACDSTGASMRKRGT - 3，MVH-R2 為5-ttctatgcgcAAGCTTttaYGARGARRMSKKKASWGWGRT - 3，MVH - R3 為5 - ttctatgcgcAAGCTTttaYGAGGAGACKGTGASHGDGGH-3。

Primers for generation of scFv genes in SOE - PCR：MscFv-F 為5-cggcatttcgtcGAATTCc-3，MscFv-R 為5-ttctatgcgcAAGCTTtta-3。

1.2.6 冠狀病毒特異性結合抗體scfv 的富集

1）抗原包被。純化抗原或人293T 細胞總蛋白分別用包被液稀釋至1～20 μg/ mL；每孔以50～100 μL 的量加入酶標板孔中，置4 ℃過夜或37 ℃吸附2 h；棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3 次，每次3～5 min，拍干。2）人293T 細胞總蛋白和冠狀病毒S 蛋白包被孔每孔加200 μL封閉液，37 ℃封閉1 h。3）封閉完成后，人293T細胞總蛋白包被孔每孔加入100 μL 封閉后的噬菌體液孵育1 h。4）同時封閉用于篩選的冠狀病毒S 蛋白包被孔1 h。5）將孵育過人293T 細胞總蛋白的噬菌體液轉移至冠狀病毒S 蛋白包被孔上進行孵育。6）擴大培養大腸桿菌TG1，37 ℃搖床至OD600為0.5左右。7）用PBS清洗液多次反復清洗冠狀病毒S蛋白包被孔。8）用100 μL 0.1 mol/L三乙胺洗脫結合到冠狀病毒S蛋白上的噬菌體顆粒。9）吸入400 μL Tris - HCl，匯同三乙胺移入EP 管。10）吸取2 μL中和的噬菌體液，加入PBS 198 μL，制備成連續的梯度溶液。用于估算每輪篩選后噬菌體的滴度，滴度=菌落個數×菌液稀釋倍數/梯度稀釋倍數×涂平板體積。11）每個梯度的200 μL噬菌體加入800 μL準備好的TG1大腸桿菌37 ℃孵育30 min，振搖（轉速為250 r/min）30 min。取10 μL 鋪平板，培養過夜。12）洗脫剩余的噬菌體，與15 mL TG1進行37 ℃孵育30 min。13）洗脫后的冠狀病毒S 蛋白抗原孔板，用100 μL TG1 孵育30 min，通過噬菌體感染TG1，回收可能和切片緊密結合三乙胺無法洗脫的噬菌體，且與回收剩余噬菌體的TG1 混合，4 500g離心5 min，棄上清液，用200 μL 培養液重新懸浮，全部涂板于15 cm 大培養板，37 ℃過夜培養。14）加入1.5 mL 培養液，將第1 輪回收得到的TG1 菌落完全刮下，用-80 ℃甘油保存。15）經過3 輪生物學篩選，能特異結合冠狀病毒S蛋白的噬菌體得到富集。

1.2.7 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）確認scfv 親和力與特異性

裂解細胞，得到蛋白裂解液，抗原包被稀釋液稀釋，過夜包被微孔板，加入噬菌體顆粒孵育，洗脫，加入帶有辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗M13 抗體孵育，洗脫，加入底物顯色液，讀取OD值，判斷抗原抗體結合情況。

2 結果

2.1 體外表達冠狀病毒S 蛋白糖蛋白亞基CoV_Spike_S1-S2_S2

根據保守結構域數據庫2020 版及蛋白數據庫cd22378，合成冠狀病毒S蛋白亞基中的保守區域，其中包括S1 亞基碳端結構域、S1/S2 斷裂區、S2 融合亞基。這段保守序列為高度致病性的CoV-2019 和嚴重急性呼吸綜合征（SARS）的共同保守序列。S 蛋白是一種病毒包膜糖蛋白，在病毒黏附、融合及進入宿主細胞的過程中起到了關鍵性作用，故被選作中和抗體、抗病毒抑制劑、疫苗等的首選靶點。S 蛋白以前體形式合成，斷裂為N 端S1亞基（約700氨基酸）和C端S2亞基（約600氨基酸），分別介導與宿主細胞的黏附和融合。3 對S1/S2二聚體組裝成一個從病毒外膜伸出的三聚體棘突。S1 亞基含有受體結合結構域（RBD）；S2 亞基含有冠狀病毒的融合結構域，主要由α 螺旋組成。S1 亞基包括兩個獨立的結構域，即N 端結構域和C 結構域，由亞結構域SD-1和SD-2鏈接到一起。根據不同的冠狀病毒類型，雖然N 端結構域和C 結構域都能作為RBD，但大多數的冠狀病毒包括SARS - CoV - 2，SARS - CoV，MERS-CoV 均使用C 結構域與受體結合。S2 亞基由含有酶解位點S2 的融合肽、內部融合肽，以及2 個7 種必需氨基酸重復的結構域HR1，HR2 及跨膜結構域組成。一旦病毒表面S1 亞基的RBD 與宿主細胞的受體結合，HR1和HR2兩個結構域彼此相互作用形成六螺旋融合核心（6-HB），使病毒和細胞膜拉近到利于融合和感染的緊密位置。為了催化膜融合過程，S蛋白需通過在S1/S2之間的位點進行斷裂，從而啟動激發S蛋白。尤其是SARSCoV-2在S1和S2亞基之間具有明顯的堿性插入序列，這一點有別于其他冠狀病毒。將合成的冠狀病毒保守DNA 序列（圖1）克隆到pet- 22 表達載體，進行體外誘導表達，發現主要以包涵體的形式進行表達（圖2）。通過8 mol/L 尿素溶解后，上樣6×His Ni 柱純化，用梯度咪唑洗脫，得到高純度溶解的S蛋白抗原片段（圖3）。

圖1 冠狀病毒S蛋白家族Fig.1 Coronavirus S protein family

M1.內參 M2.Marker 1.未誘導菌液 2.誘導菌液 3.誘導菌液破碎上清液 4.誘導菌液破碎沉淀圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳體外表達的S蛋白M1.Internal reference M2.Marker 1.Uninduced bacterial solution 2.Induced bacterial solution 3.Crushing supernatant of induced bacterial solution 4.Crushing precipitation of induced bacterial solutionFig.2 S protein expressed by polyacrylamide electrophoresis in vitro

M1.內參 M2.Marker 1.上樣前 2.上樣后 3-4.100 mmol/L咪唑-PBS-8 mol/L 尿素 5-7.250 mmol/L 咪唑-PBS-8 mol/L尿素 8.500 mmol/L咪唑-PBS-8 mol/L尿素圖3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測6×His Ni柱子純化后S蛋白抗原M1.Internal reference M2.Marker 1.Before loading sample 2.After loading sample 3 - 4.100 mmol / L imidazole - PBS - 8 mol / L urea 5 - 7.250 mmol / L imidazole - PBS - 8 mol / L urea 8.500 mmol / L imidazole - PBS - 8 mol / L ureaFig.3 S protein antigen was detected by polyacrylamide electrophoresis after purification by 6 × His Ni column

2.2 蛋白片段免疫BALB/ c 小鼠，制備抗體scfv 噬菌體展示庫

將體外表達的溶解抗原以1∶1 與弗氏完全佐劑完全乳化后，按每只小鼠50 μg劑量皮下注射免疫，2周后再次同法乳化，按每只小鼠50 μg 劑量皮下注射二次免疫；2 周后腹腔注射加強免疫，處死，取脾臟前再腹腔注射加強免疫，眼后靜脈叢取血，純化的蛋白包被微孔板，進行ELISA測定，發現免疫后的小鼠抗體應答明顯，滴度與購買標準抗體滴度相當，而未免疫的小鼠并無交叉抗體，證實S 蛋白抗原誘導產生抗血清的特異性（圖4）。取效價較高的小鼠脾臟，提取總RNA，根據小鼠抗體重鏈輕鏈引物［8-9］，分別擴增抗體DNA 重鏈和輕鏈片段，用overlap PCR 將輕重鏈合并成1 條連續的序列，通過克隆連接入pComb3XSS 質粒載體，電轉化入TG1 大腸桿菌感受態后，借助輔助噬菌體顆粒VCM13感染TG1，通過噬菌體外殼包裝得到抗冠狀病毒S 蛋白的抗體噬菌體展示庫（圖5）。

1.陽性抗體對照 2.未包被抗原 3 - 5.免疫小鼠血清A.抗體滴度測定結果 B.統計數據圖4 小鼠免疫后抗體滴度測定結果1.Positive antibody control 2.Uncoated antigens 3 - 5.Serum of immunized mouseA.Results of antibody titer determination B.Statistical dataFig.4 Determination results of antibody titer in mice after immunization

M1.DNA標記Hiclear 20 bp 1.重鏈可變區擴增片段 2.輕鏈可變區擴增片段 3.重疊PCR將重鏈輕鏈合并為1條DNA序列M2.DNA標記DL2000圖5 冠狀病毒S蛋白抗體的一段序列M1.DNA Marker Hiclear 20 bp 1.Amplified fragment of the variable heavy chain 2.Amplified fragment of the variable light chain 3.Synthesized one DNA sequence of heavy and light chains by SOE -PCR M2.DNA Marker DL2000Fig.5 A sepquence of the antibody fragment of coronavirus S protein

2.3 富集能與冠狀病毒S蛋白特異性結合的抗體scfv片段

培養人293T 細胞系，提取總蛋白，測定濃度后，包被孔板作為噬菌體展示庫的扣除背景，吸附去除能非特異性結合人細胞成分的抗體片段，孵育合成的冠狀病毒S 蛋白抗原，重復3 輪，每次用非特異性蛋白扣除后，調整相等的噬菌體滴度，用ELISA 測定噬菌體展示庫對冠狀病毒S 蛋白的特異性和親和力。結果顯示，冠狀病毒S 蛋白特異性結合的scfv 噬菌體顆粒得到了極大富集，其結合S蛋白抗原的特異性增強、親和力提高。通過幾輪以正常人細胞蛋白成分為背景，反復去除消耗能與細胞成分結合的抗體scfv片段，明顯提高了目標scfv 片段的特異性，即只與冠狀病毒S 蛋白抗原結合而不與正常細胞成分結合。能與人體細胞組織免疫親和結合的抗體片段多次扣除后，依然結合在冠狀病毒S蛋白上，其豐度顯著提高，顯著提高了多克隆抗體片段的親和結合能力（圖6）。

注：與塑料空白孔比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖6 多克隆噬菌體ELISA的結合分析結果Note：Compared with those of plastic blank holes，*P ＜0.05，**P ＜0.01.Fig.6 Binding analysis in a polyclonal phage ELISA

2.4 冠狀病毒S 蛋白特異性單克隆抗體scfv 篩選

挑選最后一輪由S 蛋白抗原富集后的scfv 抗體片段展示噬菌體顆粒，感染TG1 大腸桿菌，涂板后挑取單克隆250 個，接種至96 孔板進行過夜擴大，得到單克隆的scfv 噬菌體顆粒，用于結合篩選。分別選取合成的S蛋白抗原、人293T細胞系總蛋白裂解物及合成的冠狀病毒N 蛋白作為篩選的目標抗原和對照。經單克隆篩選，發現9 個scfv 克隆，對癌細胞和對照有明顯差異，用于進一步特異性鑒定（圖7）。結果顯示，1-10D，2-6B，3-5D等單克隆抗體的特異性和親和力差異更顯著，可選取用于進一步實驗，體內外驗證其是否具備中和冠狀病毒與宿主細胞受體相互作用的能力。

注：與BSA包被孔板比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖7 特異性結合肝癌組織的多克隆抗體scfv片段Note：Compared with those of BSA coated orifice plates，*P ＜0.05，**P ＜0.01.Fig.7 The scfv fragment of polyclonal antibody specifically binding to liver cancer tissue

3 討論

通過合成冠狀病毒S蛋白保守序列，成功表達冠狀病毒S 蛋白抗原，不僅能和市面上已知的抗體相互作用，且用于篩選潛在抗體。本研究中選用了VCM13輔助噬菌體，感染TG1 菌株，將克隆到菌株中pComb3XSS 里的抗體片段表達且包裝到噬菌體表面，用于固相篩選。同時，pComb3XSS 里的抗體片段可誘導表達成可溶性抗體片段，利于ELISA等技術分析。經多輪篩選，得到的抗體片段對于冠狀病毒S蛋白的特異性增強，親和力提高，為最終單克隆篩選奠定了基礎。雖然制備出結合病毒的多種抗體片段，但有待進一步體內中和實驗的驗證。同時，可加大篩選力度，得到更多特異性更強的結合冠狀病毒S 蛋白的抗體scfv 片段，為新的醫學診療方案提供廣泛的靶向抗體。由于冠狀病毒中nsp14的3'-5'外核糖核酸酶（ExoN）可參與RNA校對，提高保真度，在疫情早期，其復制具有高保真性［10］，導致在疫苗設計及單抗被動治療中，易忽略病毒結構的變異性。利用VSVeGFP-SARS-CoV-2嵌合病毒（VSV 糖蛋白被S蛋白取代）作為模型進行實驗，發現目前單克隆抗體（簡稱單抗）普遍靶向的RBD 結構域中的RBM 基序具有很大的容納突變的可塑性。因此，臨床采用多種非競爭性的靶向RBM 的單抗進行“雞尾酒”治療［11-12］。對S 蛋白RBD 結構域的深度分析發現，RBM 突變容納率非常高，某些突變不但不會削弱其與宿主細胞ACE 受體的結合，反而會增強這一過程［13］。這解釋了幾種單抗治療發生病毒逃逸的原因，就是RBD 中的RBM 能發生突變而躲避單抗，同時還保持甚至加強了RBD 與宿主ACE 受體結合的能力［14-19］，這也解釋了目前疫苗所產生的抗體應答絕大多數都是產生的針對抗RBM 的抗體［20］。后續研究中還可在表達菌中引入提高目的表達抗原隨機突變的功能元件，以便獲得更廣泛、多樣的抗原片段。另外，隨著抗體工程的發展，也可在具有潛力的scfv 基礎上進行各種修飾，改造抗體的半衰期及調控下游免疫事件的發生，達到控制冠狀病毒細胞間傳播的目的。

本研究中運用冠狀病毒S 蛋白保守性片段作為免疫抗原，成功誘導小鼠產生了抗冠狀病毒S蛋白的特異性抗體，且構建了小鼠抗CoV-Spike 的抗體scfv 庫，通過扣除非特異性結合細胞成分的抗體，篩選到特異性結合冠狀病毒S 蛋白抗原的特異性抗體，為進一步篩選、鑒定具有潛在防治冠狀病毒感染的抗體系列藥物提供了可行的方法。