三七莖葉總皂苷抑制七氟醚誘導的海馬神經元凋亡機制研究

文 艷，溫 旭，李 靖，李 洋，黃先全，劉 康

（1.四川省南充市中醫醫院，四川 南充 637000； 2.四川綿陽四○四醫院，四川 綿陽 621000； 3.四川省儀隴縣人民醫院，四川 南充 637600； 4.四川省南充市中心醫院，四川 南充 637000）

七氟烷誘導和恢復時間快，血/氣分配系數低，臨床常用作吸入式小兒和成人麻醉劑［1-2］。兩項前瞻性隨機平行臨床試驗表明，七氟醚暴露可加重成人患者術后認知功能障礙［3-4］，甚至可能直接改變患兒腦結構和神經認知發育［5-6］。最常見的七氟醚誘導的損傷為細胞凋亡，機制復雜多樣［7］。為此，臨床中一直在尋找對抗神經元凋亡以減輕七氟醚誘導的神經認知障礙的方法［8］。三七葉作為一種高效低毒的中草藥［9］，其根和莖已用于治療心血管疾病［10］。三七及其提取物三七皂苷具有神經保護、抗炎、抗凋亡等作用［11］。三七總皂苷主要從三七根中提取、純化獲得；三七莖葉中的主要活性成分為皂苷，化學結構主要為原人參二醇型，具有鎮靜催眠、鎮痛、調血脂、抗炎、延緩衰老等作用［12］。目前，三七莖葉總皂苷（PNSLS）已被證實具有保護神經的作用［13-14］。本研究中探討了PNSLS 對七氟醚誘導神經元凋亡的調控機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：氣密塑料室（AbbVie Inc.）；PM 8060 型氣體監測器（德國Drager 公司）；NovoCyte 型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences 公司）；Model 680 型酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

試藥：PNSLS（吉林省中醫藥研究院，批號為2018-05-08）；七氟醚（Merck Millipore，CAS號28523-86-6）；100 U/ mL 青霉素和100 μg/ mL 鏈霉素的Dulbecco's改良eagle 培養基（DMEM，美國Gibco 公司）；絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）激活劑anisomycin（批號為SC0132，10 mmol/L），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（批號為C1075M），CCK - 8 試劑盒（批號為C0037），胱天蛋白酶- 3（caspase - 3）活性檢測試劑盒（批號為C1115），BCA 蛋白質測定試劑盒（批號為P0009），均購于碧云天生物科技有限公司；抗Bax（ab32503，1∶1 000，21 000），B細胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl2，ab32124，1∶1 000，26 000），p38（ab170099，1∶1 000，42 000），p - p38（ab4822，1∶1 000，38 000），p65（ab32536，1∶1 000，65 000），IκBα（ab32518，1∶1 000，36 000），p - IκBα（1∶1 000，ab133462，36 000），78 000 葡 糖 調 節 蛋 白（GRP78，ab21685，1∶1 000，78 000），β- 微管蛋白（β- tubulin，ab6046，1∶500，50 000），Histone H3（ab1791，1∶2 000，15 000），均購于美國Abcam 公司；內質網應激相關蛋白（CHOP，Cell Signaling Technology，# 5554S，1∶1 000，27 000）。

細胞：小鼠海馬神經元細胞系HT22（rocellLifeScience&Technology Co.，Ltd.，批號為CL-0697，以下簡稱HT22細胞）。

1.2 方法

細胞處理與分組：使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 于37 ℃、5%CO2加濕培養溫箱中培養HT22 細胞，在具有入口和出口連接器的氣密塑料室中進行細胞培養暴露。氣密塑料室的入口用于調節七氟醚的濃度，與七氟醚蒸發器相連；用載氣（95%空氣、5%CO2）中0，4.1%，8%七氟醚對氣密塑料室充氣15 min，利用氣體監測器監測氣密塑料室出口的七氟醚濃度，直至達到目標濃度。37 ℃溫度下保持密封6 h，對照細胞在37 ℃、5%CO2潮濕環境中生長，且不暴露于七氟醚。將HT22細胞分為對照組（Control組）；暴露于4.1%七氟醚的細胞組（Sev 組）；使用6 μg/ mL PNSLS對細胞進行預處理1 h，再將細胞暴露于4.1%七氟醚組（Sev + PNSLS 組）；于PNSLS 處理前1 h 加入MAPK激活劑anisomycin（An）再暴露于七氟醚和PNSLS的共培養組（Sev+PNSLS+An組）。

CCK-8法測定細胞活力：取HT22細胞（1×104個/孔），接種于96 孔板中，培養過夜，使細胞附著在板底部，向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，放回培養箱中繼續培養2 h。從96孔板取出，并置多功能酶標儀中，于450 nm 波長處測量每個孔的吸光度（OD），計算HT22細胞的相對活力。

細胞凋亡個數檢測：為驗證三七莖葉總皂苷對七氟醚誘導的神經元凋亡的保護作用，將質量濃度分別為1.5，3，6，12 μg/mL 的PNSLS與先前暴露于4.1%七氟醚的HT22 細胞進行孵化。將不同處理組細胞接種至12孔板（8×104個/孔）中，48 h后用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并收集細胞，根據Annexin V -FITC/ PI 凋亡試劑盒說明書進行操作。于37 ℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡個數。

比色活性測定試劑盒測量caspase - 3 活性：收集HT22細胞，并在冰上的裂解緩沖液中孵育15 min，取裂解物，離心（15 000g、4 ℃）15 min，用BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。取10 μL裂解物，置80 μL反應緩沖液中（含10 μL 0.2 mmol/ L Ac - DEVD - pNA），于37 ℃溫度下孵育2 h。用酶標儀于405 nm波長處測定OD。

免疫印跡（Western Blot）法測定內質網應激反應相關蛋白表達水平：為探討七氟醚誘導的內質網應激反應對HT22 細胞的影響，在處理細胞6 h 后，評估內質網應激相關蛋白。用RIPA 裂解液提取HT22 細胞蛋白，離心（10 000g）10 min，提取上清液，用雙辛烷酸蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；將20 μg 蛋白質樣品在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上分離，并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；將PVDF膜置阻斷緩沖液中孵育1 h，加入抗Bax，Bcl2，p38，p -p38，p65，IκBα，p - IκBα，GRP78，CHOP，β- tubulin，Histone H3，并孵育過夜；第2 天，用Tris - 緩沖鹽水/Tween 20 清洗膜，用相應辣根過氧化物酶（HRP）結合的第二抗體孵育1 h。用高效化學發光（ECL）溶液測量成像發展系統中蛋白質的表達水平，以β- tubulin 和Histone H3為內參蛋白計算細胞或細胞核蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。檢驗符合正態分布且方差齊時，計量資料以±s表示，行獨立樣本t檢驗；多組間比較采用One-Way ANOVA 分析；事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 七氟醚抑制神經元活力

與七氟醚體積分數為0時比較，暴露于4.1%或8%七氟醚后，細胞活力均顯著降低（P＜0.001），詳見圖1。用8%七氟醚的培養基處理神經元時，未發現神經元活力與4.1%七氟醚處理發生顯著變化，故選取4.1%七氟醚處理神經元6 h。

注：*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。圖2至圖9同。圖1 CCK-8法檢測七氟醚對HT22細胞神經元活力的影響Note：*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1 - 9）.Fig.1 Effect of sevoflurane on neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

2.2 PNSLS 增加神經元活力并抑制神經元凋亡

結果顯示，與Sev + 3 μg/mL PNSLS組比較，Sev +6 μg/mL PNSLS組細胞活力顯著升高（P＜0.01），詳見圖2。故選取6 μg/mL PNSLS作為治療濃度。流式細胞術結果顯示，PNSLS可顯著抑制神經元凋亡（P＜0.01），詳見圖3。Western blot 法結果顯示，與Sev 組比較，Sev+PNSLS組細胞中凋亡蛋白Bax表達水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著升高（P＜0.01），詳見圖4。且七氟醚處理后caspase-3活性顯著增加，而PNSLS可逆轉這一現狀（P＜0.01），詳見圖5。可見，PNSLS能增加神經元活力。

圖2 CCK-8法檢測三七莖葉總皂苷對HT22細胞神經元活力的影響Fig.2 Effect of PNSLS on the neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

A-C.流式細胞圖（分別為Control組、Sev組、Sev + PNSLS組） D.柱狀圖圖3 AnnexinV-FITC/PI法檢測三七莖葉總皂苷對HT22細胞神經元凋亡率的影響A-C.Flow cytometry（Control group，Sev group，Sev+PNSLS group） D.HistogramFig.3 Effect of PNSLS on neuronal apoptosis of HT22 cells detected by the AnexinV - FITC/PI method

圖4 Western blot法檢測三七莖葉總皂苷對神經元凋亡相關蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of PNSLS on the expression level of neuronal apoptosis-related proteins detected by the Western blot

圖5 比色法檢測三七莖葉總皂苷對caspase-3活性的影響Fig.5 Effect of PNSLS on caspase-3 activity detected by the colorimetric assay

2.3 PNSLS 抑制七氟醚觸發的內質網應激反應

Western blot 法結果顯示，與Control 組比較，Sev 組和Sev+PNSLS組的GRP78和CHOP表達水平均顯著升高；與Sev 組比較，Sev+PNSLS 組的GRP78 和CHOP 表達水平均顯著降低（P＜0.01），詳見圖6。可見，七氟醚可能通過觸發內質網應激反應誘導的凋亡信號通路促進HT22細胞凋亡，而PNSLS能部分逆轉此凋亡。

圖6 Western blot法檢測三七莖葉總皂苷對七氟醚觸發的內質網應激反應相關蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of PNSLS on the expression level of sevofluranetriggered endoplasmic reticulum stress-related proteins detected by the Western blot

2.4 PNSLS 介 導p38 MAPK / 核轉錄因子- κB（NF-κB）p65 信號通路調節七氟醚誘導的神經元凋亡

結果顯示，七氟醚可升高p38 及IκBα 的磷酸化水平，以及NF - κB p65 向細胞核的核轉位，而PNSLS 可逆轉以上現象（P＜0.01），詳見圖7。為進一步驗證PNSLS 介導p38 MAPK/ NF - κB p65 信號通路逆轉七氟醚誘導的神經元凋亡現象，在使用PNSLS 及七氟醚的HT22 細胞中額外添加MAPK 激活劑anisomycin 對p38 MAPK/ NF - κB p65 通路進行激活。結果顯示，MAPK 激活劑anisomycin 使p38 和細胞質中IκBα 的磷酸化水平顯著升高（P＜0.01），細胞質中NF - κB p65水平顯著降低（P＜0.01），詳見圖7。CCK- 8 法及流式細胞術結果顯示，激活p38 MAPK/ NF - κB p65 通路，可抑制神經元活力，促進神經元凋亡（P＜0.05），詳見圖8 和圖9。可見，PNSLS 通過介導p38 MAPK/NF-κB p65信號通路而調節七氟醚誘導的神經元凋亡。

圖7 Western blot法檢測三七莖葉總皂苷對p38 MAPK/NFκB p65信號通路相關蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of PNSLS on the expression levels of p38 MAPK/NF-κB p65 signaling pathway-related proteins detected by the Western blot

圖8 CCK-8法檢測MAPK激活劑對HT22細胞神經元活力的影響Fig.8 Effect of MAPK activator on neuronal activity of HT22 cells detected by the CCK-8 assay

A-B.流式細胞圖（分別為Sev+PNSLS組、Sev+PNSLS+An組） C.柱狀圖圖9 Annexin V-FITC/PI法檢測MAPK激活劑對HT22細胞凋亡率的影響A-B.Flow cytometry（Sev+PNSLS group，Sev + PNSLS + An group）C.HistogramFig.9 Effect of MAPK activator on apoptosis of HT22 cells detected by the Annexin - V FITC/PI method

3 討論

七氟醚為常用吸入性麻醉劑［15］，七氟醚麻醉的神經保護作用或神經毒性作用尚存在爭議［16］。研究表明，神經炎癥、鈣失衡、神經元凋亡和氧化應激反應增強與七氟醚誘導的認知障礙密切相關［17-19］。據報道，4.1%七氟醚處理6 h 可顯著誘導海馬神經元凋亡；七氟醚可引發內質網應激反應，并可能導致神經元細胞凋亡［20］。內質網在超過1/ 3 蛋白質的合成、折疊和結構成熟中起重要作用［21］，其應激誘導的凋亡是神經疾病過程和神經元細胞死亡中的重要病理事件［22-23］。本研究結果顯示，4.1%七氟醚顯著抑制HT22 細胞的增殖并促進細胞凋亡；4.1% 七氟醚暴露可增加HT22 細胞中GRP78 和CHOP 蛋白表達水平及caspase - 3 活性，而PNSLS可逆轉上述現象。

MAPK 家族是細胞表面受體和基因表達決定簇之間的重要信號調節酶［24］，包括胞外信號調節激酶1/ 2（ERK1/ 2）、c - Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）、p38、ERK5［25］，控制著幾乎所有的生理功能和過程，如細胞適應、增殖、分化、存活和程序性細胞死亡［26］。p38 MAPK 是絲氨酸/蘇氨酸MAPK 家族中高度保守的成員，其主要功能是向細胞傳遞細胞外信號［27］，可調節細胞增殖、分化、炎性反應、氧化應激反應、凋亡等病理生理過程［28-29］。p38 MAPK 信號通路參與缺血性腦損傷后大量神經元的晚期凋亡［26］，是缺血再灌注損傷誘導細胞凋亡的重要信號轉導途徑之一，與內質網應激激活有關［30-31］，在嚴重或持續的內質網應激反應下，p38 MAPK 磷酸化導致細胞功能障礙［32］。本研究結果顯示，PNSLS 可減弱七氟醚誘導HT22 細胞p38 MAPK 磷酸化及內質網應激反應。

NF-κB是一種常見的核轉錄因子，廣泛存在于細胞質中，并在細胞受到刺激時充當信號通路［33］。作為一種經典的炎性反應和氧化應激反應信號通路，NF-κB p65 信號通路通過調節趨化細胞因子、黏附分子、生長因子和各種酶的基因表達，在機體的炎性反應、免疫調節和細胞凋亡中發揮重要作用［34-35］。本研究結果顯示，七氟醚可激活p38 MAPK/ NF - κB p65 通路，促使NF - κB p65 向細胞核的核轉位，而PNSLS 可抑制該通路活性，經額外的MAPK 激活劑處理HT22 細胞的細胞活力顯著下降，細胞凋亡顯著上升。

綜上所述，PNSLS通過介導p38 MAPK/NF-κB p65信號通路而抑制七氟醚誘導的神經元凋亡。但本研究僅探討了細胞進程，未來研究中應開展動物體內實驗。