電子束輻照對訶子中主要活性成分及滅菌效果的影響*

汪慧慧，謝和兵，尼瑪次仁，張國慶，伍 麗，王彩芬，張繼穩△

（1.江西中醫藥大學藥學院，江西 南昌 330004； 2.江蘇云視藥物科技有限公司，江蘇 南通 226133；3.江蘇省南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133； 4.西藏神猴藥業有限責任公司，西藏日喀則 857000； 5.中國科學院上海藥物研究所，上海 201210）

藏藥訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實［1］，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽功效。現代藥理學研究表明，訶子具有抗氧化［2-3］、抗腫瘤［4-5］、修復肝功能損傷［6-7］、抗菌［8］等活性。在藏醫藥中，訶子使用頻率幾乎與漢醫方劑中甘草等同，被視為藏藥之王［9］。傳統藏成藥中訶子多以生藥粉直接入藥，微生物水平為重要質控指標。酚酸類物質為訶子中主要發揮藥理作用的成分［10-11］，受熱不穩定，在干熱、濕熱滅菌過程中會發生聚合、水解、氧化等反應而降低含量，影響藥效［12］。目前，藏藥企業常用的熱滅菌方式并不適用于訶子的滅菌。電子束輻照滅菌技術能最大限度地保持中藥材的性狀、活性成分、藥理作用等［13］。本研究中比較了不同輻照劑量對訶子的性狀，薄層色譜，主要活性成分沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸含量，指紋圖譜相似度和微生物水平的影響，為藏藥訶子的電子束輻照滅菌技術與標準的制訂提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZ - 10/ 20 型電子加速器（安徽戈瑞電子科技股份有限公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DHG-9240A型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；MSA125P - CE 型電子分析天平（賽多利斯＜北京＞科學儀器有限公司，精度為0.01 mg）；1730R 型離心機（上海貝晶生物技術有限公司）；SB -5200DT 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為120 W，頻率為40 kHz）；KWF-20 型超微粉碎機（浙江瑞昊機器制造有限公司）；Master-S15UR型純水儀（上海和泰儀器有限公司）；N-1300型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 試藥

訶子（西藏神猴藥業有限責任公司，批號為20200201），經西藏神猴藥業有限責任公司尼瑪次仁副主任藥師鑒定為正品；沒食子酸對照品（批號為110831-201906，含量≥91.50%），柯里拉京對照品（批號為111623 -200302），鞣花酸對照品（批號為111959 - 201903，含量≥88.80%），訶子對照藥材（批號為121015 -201605），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，批號為221027100215），乙腈（色譜純，批號為221013100157），磷酸（優級純，批號為71807089），均購于上海邁瑞爾化學技術有限公司；冰醋酸（分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司，批號為C14357167）；乙醇（批號為20220826），硫酸（批號為20210514），甲苯（批號為20211209），均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；水為純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 樣品制備與輻照處理

取訶子樣品適量，粉碎，過9號篩，分裝于鋁箔袋密封儲存，每袋12 g。由中廣核戈瑞科技有限公司采用電子加速器對訶子粉末進行滅菌處理，設置輻照劑量分別為0，2，4，6，8，10 kGy，各6袋。

2.2 性狀比較

于日光下觀察訶子粉末的外觀聚集狀態，通過口嘗、鼻嗅等對其性味進行直觀判斷。與未輻照樣品（0 kGy）比較，輻照前后訶子粉末外觀、色澤、氣味均未發生明顯變化，表明電子束輻照滅菌技術對訶子粉末性狀無明顯影響。詳見圖1。

圖1 輻照前后訶子粉末的性狀Fig.1 Properties of TCL powders before and after irradiation

2.3 薄層色譜鑒別

取未輻照（0 kGy）及不同輻照劑量（2，4，6，8，10 kGy）下的訶子粉末0.5 g，精密稱定，加入30 mL 無水乙醇，加熱回流30 min，抽濾，濾液旋轉蒸干，加5 mL 甲醇溶解殘余物，通過中性氧化鋁柱（100～200 目，5 g，內徑2 cm），加50 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干；加5 mL 純水溶解殘渣，通過C18固相萃取柱（300 mg），加10 mL 30%甲醇洗脫，棄去洗脫液；加10 mL 甲醇第2次洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干；殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取訶子對照藥材0.5 g，同法制備對照藥材溶液。參照2020 年版《中國藥典（四部）》0502 薄層色譜法試驗，取上述2 種溶液各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 冰醋酸- 水（12∶10∶0.4，V/V/V）為展開劑，展開，取出，干燥，噴以10%乙醇硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下觀察。結果未經輻照處理（0 kGy）的訶子粉末和2，4，6，8，10 kGy 輻照劑量下的訶子粉末的供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點（比移值為0.69），表明訶子粉末經電子束輻照滅菌后的薄層色譜無明顯改變。詳見圖2。

1.對照藥材溶液 2 - 7.供試品溶液（輻照劑量依次為0，2，4，6，8，10 kGy）圖2 輻照前后訶子粉末薄層色譜圖1.Reference medicinal materials solution 2-7.Test solution（irradiation doses of 0，2，4，6，8，10 kGy in sequence）Fig.2 TLC chromatograms of TCL powders before and after irradiation

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度 洗 脫（0～15 min 時3%B →10%B，15～20 min 時10%B →14%B，20～30 min 時14%B →17%B，30～35 min時17%B →21%B，35～45 min時21%B →60%B，45～56 min時60%B →3%B）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：10 μL。

2.4.2 溶液制備

分別取沒食子酸對照品10.02 mg、柯里拉京對照品10.04 mg、鞣花酸對照品10.02 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別制得質量濃度為0.917，1.004，0.890 mg/mL的對照品貯備液。分別精密吸取沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸對照品貯備液2.0，1.0，2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇-0.1%磷酸水溶液（7∶3，V/V）定容，搖勻，制成沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸質量濃度分別為183.4，100.4，178.0 μg/mL 的混合對照品溶液。

取未經輻照的樣品粉末（過9 號篩）0.1 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 mL，稱定質量，超聲處理（功率為120 W，頻率為40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4.3 方法學考察

專屬性試驗：取空白溶劑（70%甲醇）及2.4.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，70%甲醇對沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸無干擾，供試品溶液色譜中，各活性成分沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸與相鄰色譜峰的分離度、拖尾因子、理論板數均符合《中國藥典》標準。詳見圖3。

1.沒食子酸 2.柯里拉京 3.鞣花酸A.空白溶劑（70%甲醇） B.混合對照品溶液 C.供試品溶液圖3 高效液相色譜圖1.Gallic acid 2.Corilagin 3.Ellagic acidA.Blank solvent（70% methanol） B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.4.2項下混合對照品溶液適量，加甲醇-0.1%磷酸水溶液（7∶3，V/V）逐級稀釋，得沒食子酸質量濃度分別為183.4，91.70，45.85，18.34，9.170，4.585 μg/mL，柯里拉京質量濃度分別為100.4，50.20，25.10，10.04，5.020，2.510 μg/mL，鞣花酸質量濃度分別為178.0，89.00，44.50，17.80，8.900，4.450 μg/mL 的混合對照品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，以3 種待測成分的質量濃度（X，μg/ mL）為橫坐標、色譜峰峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察與定量限和檢測限確定結果Tab.1 Results of linear relation test，limits of quantification，and limits of detection

定量限與檢測限確定：取2.4.2項下混合對照品溶液，加甲醇-0.1%磷酸水溶液（7∶3，V/V）等比稀釋，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，檢測限按信噪比（S/N）≥3計算，定量限按S/N≥10計算。結果見表1。

精密度試驗：取2.4.2 項下混合對照品溶液適量，按2.4.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.18%，0.15%，0.22%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取未經輻照的樣品粉末（過9號篩）適量，按2.4.2 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。根據標準曲線計算得沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸含量的RSD分別為1.25%，1.36%，1.73%（n= 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取未經輻照的樣品粉末（過9號篩）適量，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液，分別于常溫下放置0，2，4，6，8，12 h 時按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸峰面積的RSD分別為0.33%，1.88%，1.39%（n=6），表明供試品溶液在常溫放置12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取6 份未經輻照的樣品粉末（過9 號篩）0.1 g，精密稱定，加入與供試品中含量100%的混合對照品溶液，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery rest（n=6）

2.4.4 輻照樣品含量測定

取不同輻照劑量（0，2，4，6，8，10 kGy）輻照后的訶子樣品，按2.4.2 項下方法制備供試品溶液各3 份，按2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以外標法計算3種成分的含量，采用SPSS 27.0統計學軟件分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。結果顯示，與未經輻照樣品比較，不同輻照劑量輻照后訶子的主要活性成分沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的含量無顯著差異（P＞0.05）。詳見表3。

表3 不同輻照劑量對訶子中沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸含量的影響（mg/g，n=3）Tab.3 Effect of different irradiation doses on the contents of gallic acid，corilagin and ellagic acid in TCF（mg/g，n=3）

2.5 指紋圖譜相似度

通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）對所得色譜圖進行處理，以未經輻照樣品（0 kGy）供試品溶液色譜圖為參照，經多點校正后進行全譜峰匹配，自動生成對照圖譜（R），詳見圖4。計算相似度，各劑量輻照樣品與未經輻照（0 kGy）樣品的相似度均不低于0.998，詳見表4。

表4 輻照前后訶子樣品的指紋圖譜相似度Tab.4 Fingerprint similarity of TCF before and after irradiation

圖4 輻照前后訶子供試品溶液的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.4 HPLC overlay fingerprints of the test solution of TCF before and after irradiation

2.6 微生物檢測

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則中非無菌產品微生物限度檢查（1105 微生物計數法、1106 控制菌檢查法、1107 非無菌藥品微生物限度標準），檢查電子束加速輻照前后訶子粉末中細菌菌落總數、霉菌及酵母菌菌落總數、大腸菌群的變化。結果顯示，樣品經輻照后，細菌菌落總數、霉菌及酵母菌菌落總數均顯著下降（P＜0.05），大腸菌群在輻照前后均未檢出；當輻照劑量為4 kGy 時，微生物限度已滿足《中國藥典》規定標準，輻照劑量為6 kGy 及以上時微生物均未檢出。詳見表5。

表5 不同輻照劑量對訶子微生物含量的影響（n=2）Tab.5 Effect of different radiation doses on microbial contents of TCF（n=2）

3 討論

3.1 電子束輻照劑量選擇

電子束輻照滅菌技術是利用電子加速器產生的高能電子束照射物質達到滅菌目的［14］，具有流水線快速、吸收劑量均勻、建設防護成本低等優點，廣泛用于食品、化學藥品、中藥材及醫療器械的滅菌［15-17］。目前，電子束輻照滅菌技術應用于藏藥材的滅菌已取得顯著成效［18-19］，但常用藏藥材及生藥粉的相關研究依然較少。根據2015 年原國家食品藥品監督管理總局發布的《中藥輻照滅菌技術指導原則》規定輻照劑量原則上不超過10 kGy。故本研究中輻照劑量選擇2，4，6，8，10 kGy，以確保中藥的安全、有效與質量穩定。

3.2 訶子主要活性成分選擇

訶子中的主要活性成分為酚酸類、鞣質類和黃酮類物質［20］，其中酚酸類和鞣質類物質含量較高，具有抗氧化、抗菌、抗癌、促進平滑肌收縮等藥理學作用［21］，被認為是訶子質量評價的重要指標［10，22］。沒食子酸為訶子酚酸類的一種成分，具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用，效果遠高于維生素C［23-24］。鞣質類成分中的鞣花酸和柯里拉京可調節不同癌細胞的信號通路而發揮抗癌作用，同時可解除致癌物的毒性［25］。故本研究中選擇沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸作為主要活性成分指標。

3.3 主要活性成分的含量測定

參考文獻［11，26］，對訶子中沒食子酸、鞣花酸和柯里拉京的測定方法進行優化，分別考察了流動相（0.1%磷酸水溶液- 乙腈、水- 乙腈），柱溫（25，30，35 ℃），供試品溶液制備方法（50%甲醇、70%甲醇），對照品稀釋溶液［甲醇、70%甲醇、甲醇-0.1%磷酸水溶液（7∶3，V/V）］對樣品中各成分色譜峰的分離效果，確定最優條件為流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈，柱溫為30 ℃，樣品提取溶劑為70%甲醇，對照品稀釋溶液為甲醇-0.1%磷酸水溶液（7∶3，V/V）。由于沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸的極性差異較大，采用單一流動相比例無法分離，通過梯度洗脫可有效分離3 種成分。故流動相選擇梯度洗脫。

3.4 方法評價

不同輻照劑量的電子束輻照對訶子粉末性狀、薄層色譜鑒別、指紋圖譜、主要活性成分含量均無顯著影響，輻照劑量為4 kGy 時已達良好的滅菌效果。本研究中為電子束輻照滅菌技術對藏藥材訶子的適用性研究，為藏藥材訶子、含訶子生藥粉的藏成藥及含酚酸類有效成分藥物的輻照滅菌提供了參考。所建立的同時測定訶子中沒食子酸、柯里拉京和鞣花酸含量的高效液相色譜法操作簡便、結果準確，為訶子藥材質量標準的提升提供了參考。