高效液相色譜法同時測定馬蘭中香草酸、阿魏酸和芹菜素含量*

楊 宇，江忠敏，倪 玲，王加虎，楊澤榮，劉淑瓊，張 美

（云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500）

馬蘭Kalimeris indica（L.）Sch - Bip 為菊科馬蘭屬植物的干燥帶根全草，廣東、福建稱為田邊菊、路邊菊，四川、貴州、廣西、湖北稱為泥鰍菜、泥鰍串，云南稱為蓑衣蓮，具有清熱解毒、消食積、利小便、散瘀止血功效。馬蘭營養價值豐富，含多種維生素、氨基酸及礦物質，幼葉通常作為蔬菜食用［1-3］；含有黃酮類、三萜類、酚類、揮發油、生物堿等化學成分，具有抗菌、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、抗氧化、保肝、鎮咳、中樞抑制等多種藥理學作用［4-7］。本研究中建立了同時測定不同產地馬蘭中香草酸、阿魏酸和芹菜素含量的高效液相色譜（HPLC）法，以更好地控制馬蘭的質量，為進一步合理開發和利用馬蘭提供科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀及Waters 2998PDA型檢測器（沃特世科技＜上海＞有限公司）；SK3300H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，功率為180W，頻率為53 kHz）；Sartorius BS224S型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為萬分之一）；Milli-Q型超純水制水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

香草酸對照品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司，批號為DRE - C17900500E，含量不低于98%）；阿魏酸對照品（成都普利斯生物科技有限公司，批號為2021092201，含量不低于98%）；芹菜素對照品（成都德思特生物技術有限公司，批號為DSTDQ002602，含量不低于98%）；甲醇（BCR International Trading Inc.，批號為0212190802）；磷酸（分析純，天津市風船化學試劑有限公司，批號為20100606）；水為超純水；馬蘭采自云南保山、云南昭通、云南昆明、云南麗江、云南楚雄、云南曲靖、四川瀘州、貴州安順、江西吉安，批號分別為202008A1-202008A9），經云南中醫藥大學李學芳教授鑒定均為正品，干燥后置密封袋中于陰涼干燥處保存，備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Supersil ODS2柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時85%B →80%B，10～20 min 時80%B →60%B，20～40 min 時60% →55%B，40～55 min 時55%B →45%B，55～60 min 時45%B →80%B）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。理論板數以香草酸、阿魏酸、芹菜素計均不低于4 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

取香草酸、阿魏酸、芹菜素對照品各適量，精密稱定，置100 mL 干燥潔凈的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，充分搖勻，得香草酸、阿魏酸、芹菜素質量濃度分別為19.8，150，201 μg/mL的混合對照品溶液。

分別取不同產地馬蘭的干燥藥材粉碎，過250 μm藥篩，取樣品粉末1 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲提取40 min，取出，放冷，充分搖勻，抽濾，在濾渣中加甲醇20 mL，再次超聲提取20 min，充分搖勻，抽濾，合并2次濾液，濃縮，干燥，加甲醇充分溶解并定容至5 mL，0.22 μm微孔有機濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液0.1，0.5，1，2，7 mL，分別轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成香草酸質量濃度分別為0.198，0.990，1.980，3.960，13.860 μg/ mL，阿魏酸質量濃度分別為1.500，7.500，15.000，30.000，105.000 μg/mL，芹 菜 素 質 量 濃 度 分 別 為2.010，10.050，20.100，40.200，140.700 μg/ mL 的系列混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以香草酸、阿魏酸、芹菜素的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y香= 15 649X香+ 3 348.3（r= 0.999 6，n= 5），Y阿= 7 648.7X阿+ 3 499.3（r=0.999 6，n=5），Y芹=10 322X芹+3 652.1（r=0.999 7，n= 5）。結果表明，香草酸、阿魏酸、芹菜素的質量濃度分別在0.198～13.860 μg/mL、1.500～105.000 μg/mL、2.010～140.700 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定5 次，記錄峰面積和保留時間。結果香草酸、阿魏酸、芹菜素峰面積的RSD分別為1.22%，0.11%，0.12%（n=5），保留時間的RSD分別為0.02%，0.03%，0.02%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為202008A1）樣品1 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，于室溫條件下放置0，6，12，18，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積和保留時間。結果香草酸、阿魏酸、芹菜素峰面積的RSD分別為2.65%，1.28%，0.95%（n=5），保留時間的RSD分別為0.11%，0.10%，0.04%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為202008A1）樣品1 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行5 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積和保留時間，并計算含量。結果香草酸、阿魏酸、芹菜素的平均含量分別為0.191，0.890，15.219 μg/mL，含量RSD分別為3.94%，3.70%，1.86%（n=5），保留時間的RSD分別為0.43%，0.20%，0.21%（n=5），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為202008A1）1 g，精密稱定，分別加入2.2 項下混合對照品溶液適量，平行6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取9 批樣品各1 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，各3 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果見表2。

表2 樣品中香草酸、阿魏酸、芹菜素含量測定結果（%，n=3）Tab.2 Results of content determination of vanillic acid，ferulic acid，and apigenin in samples（%，n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇［8-16］

為使待測成分均勻流出色譜柱，本研究中采用梯度洗脫的方式，比較了甲醇-水和甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時的色譜圖，結果采用甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時的色譜峰分離較好，3 種待測成分與其他干擾色譜峰分離良好，峰形較好。故選擇此流動相進行梯度洗脫。

3.2 指標性成分選擇

馬蘭化學成分豐富，其中黃酮類化合物是馬蘭的活性成分之一，具有止咳、祛痰、平喘、抗菌等作用，芹菜素是馬蘭主要的黃酮類成分之一。馬蘭還含有酚酸類成分阿魏酸和香草酸，阿魏酸具有抗氧化、抗炎、抗凝、解毒、肝臟保護、免疫調節等作用；香草酸在體內具有改善血糖、血壓及保護肝臟、腎臟、心臟功能等生物活性［15-19］。故選擇芹菜素、香草酸和阿魏酸作為含量測定的指標性成分。馬蘭中香草酸、阿魏酸、芹菜素的含量受產地影響較大，這可能與藥材的生長地理位置、環境氣候等因素有關。

3.3 方法評價

本研究中所建立的方法操作簡便、結果準確可靠，可用于同時測定馬蘭中香草酸、阿魏酸、芹菜素的含量。