基于色譜法篩查及驗證杞菊地黃口服液中抑菌劑*

吳 芳，王夢琪，羅定強，楊燕子，戴 涌

（陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

中藥口服液制劑的生產過程中，常用苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸酯類等作為抑菌劑［1-2］，以抑制微生物的生長和繁殖，在有效期內保證藥品的質量。但部分抑菌劑對人體可產生一定毒副作用，如苯甲酸鈉對肝、腎有一定損害，長時間大量攝入可能引起哮喘、蕁麻疹等不良反應；對羥基苯甲酸酯類有弱雌激素活性。2020年版《中國藥典》及藥品說明書、藥品標準中均對允許使用的抑菌劑品種和使用量有明確規定，生產時不可隨意更改。杞菊地黃口服液由枸杞子、菊花、熟地等8味中藥材組方，具有滋腎養肝功效。現行質量標準收載于《衛生部部頒標準·中藥成方制劑第十一冊》WS3- B -2146-96，對抑菌劑的描述為“加入抑菌劑適量”，規定不明確，但其藥品說明書和外包裝中均明確標示了品種和用量。為防止部分企業增添、更改抑菌劑的用量及品種，本研究中建立了常用抑菌劑的篩查及驗證方法，并對市場上的杞菊地黃口服液進行了篩查。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC2030-3D 型高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；Qtrap5500 型液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）儀（美國AB公司）。

1.2 試藥

苯甲酸對照品（批號為100419 - 201703，純度為99.9%），山梨酸對照品（批號為190126-201501，純度為99.6%），對羥基苯甲酸甲酯對照品（批號為100278-201705，純度為100%），對羥基苯甲酸丙酯對照品（批號為100444 - 201403，純度為99.6%），對羥基苯甲酸丁酯對照品（批號為110792 - 200503，純度為100%），均購自中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲酸乙酯對照品（德國Dr.Ehrenstorfer Quality 公司，批號為G128088，純度為99.0%）；乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純）；杞菊地黃口服液（7家生產企業，共65批，其中批號為170901的用于含量測定）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯 度洗 脫（0～9 min 時3%A，9～45 min 時3%A →85%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：255 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：精密量取樣品1 mL，置50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L 乙酸銨溶液（6∶94，V/V）溶解并定容，搖勻，濾過，即得。

對照品溶液：分別取苯甲酸對照品16.51 mg、山梨酸對照品12.98 mg、對羥基苯甲酸乙酯對照品19.16 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（6∶94，V/V）適量使溶解，定容，搖勻，制成質量濃度分別為329.870，258.562，379.368 μg/mL 的對照品貯備液；取對羥基苯甲酸甲酯對照品8.59 mg、對羥基苯甲酸丙酯對照品7.95 mg、對羥基苯甲酸丁酯對照品8.87 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，加乙腈- 0.02 mol/ L 乙酸銨溶液（6∶94，V/V）適量使溶解，定容，搖勻，制成質量濃度分別為171.800，158.364，177.400 μg/ mL 的混合對照品貯備液。精密量取苯甲酸對照品貯備液、山梨酸對照品貯備液各5 mL，對羥基苯甲酸乙酯對照品貯備液1 mL，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合對照品貯備液5 mL，置同一25 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（6∶94，V/V）稀釋并定容，搖勻，制成質量濃度分別為65.97，51.71，15.18，34.36，31.67，35.48 μg/mL的混合對照品溶液。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備不含抑菌劑的陰性樣品，精密量取陰性樣品1 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果對照品溶液和供試品溶液中各色譜峰的分離度良好，供試品溶液（批號為170901）中檢出苯甲酸和對羥基苯甲酸乙酯，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

1.苯甲酸 2.山梨酸 3.對羥基苯甲酸甲酯 4.對羥基苯甲酸乙酯 5.對羥基苯甲酸丙酯 6.對羥基苯甲酸丁酯A.混合對照品溶液 B.供試品溶液（批號為170901） C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Benzoic acid 2.Sorbic acid 3.Methyl 4 - hydroxybenzoate 4.Ethyl 4 - hydroxybenzoate 5.Propyl 4 - hydroxybenzoate 6.Butyl 4 -hydroxybenzoateA.Mixed reference solution B.Test solution（batch number：170901）C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察與檢測限確定：精密量取2.2項下混合對照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，15.0，25.0，50.0 μL，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，以各抑菌劑的進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積響應值（Y）為縱坐標進行線性回歸；以各抑菌劑響應值信噪比（S/N）為3∶1時的含量為檢測限。結果見表1。

表1 6種抑菌劑線性關系考察與檢測限確定結果（n=7）Tab.1 Results of the linear relation test and the limit of detection of six bacteriostatic agents（n=7）

精密度試驗：分別精密量取2.2項下苯甲酸對照品溶液、山梨酸對照品貯備液各5 mL，對羥基苯甲酸乙酯對照品貯備液1 mL，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合對照品貯備液5 mL，置同一50 mL容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（6∶94，V/V）稀釋并定容，搖勻，制成質量濃度分別為32.987，25.856，7.587，17.180，15.836，17.740 μg/ mL 的混合對照品溶液，精密量取上述對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄峰面積。結果苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯色譜峰面積的RSD分別為0.61%，0.13%，0.12%，0.22%，0.40%，0.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密量取樣品（批號為170901）1 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，4，8，12，16，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯峰面積的RSD分別為0.41%和0.44%（n= 7），表明供試品溶液在常溫下24 h內穩定性良好。

重復性試驗：精密量取樣品（批號為170901）1 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果苯甲酸和對羥基苯甲酸乙酯含量的RSD分別為0.81%和0.34%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為170901）0.5 mL，置50 mL容量瓶中，精密量取苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯對照品溶液（質量濃度分別為329.870，258.562，171.800，37.937，158.364，177.400 μg/ mL）各3 mL，置同一50 mL 容量瓶中，加乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（6∶94，V/V）稀釋并定容，搖勻，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 LC-MS/MS 法驗證

采用LC 法對全部樣品進行初步篩查，有12 批樣品的色譜圖中除檢出標示的抑菌劑苯甲酸的色譜峰外，還檢出疑似對羥基苯甲酸乙酯色譜峰。故采用LC-MS/MS法對可疑色譜峰進行確證，檢測模式為多反應監測（MRM）模式；離子源為電噴霧電離（ESI）；碰撞氣為氮氣；掃描方式為負離子掃描；母離子質荷比（m/z）為165.000；子離子m/z為137.100，91.900，去簇電壓（DP）均為-80.000 V，碰撞電壓（CE）為-18.000 V 和-28.000 V。結果對羥基苯甲酸乙酯對照品溶液和2 批供試品溶液離子對色譜峰的相對保留時間均為4.26；離子比率分別為64.60%，63.86%，65.23%，偏差均小于±10%。故確認該色譜峰為對羥基苯甲酸乙酯。

2.5 樣品中抑菌劑含量測定

取65 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。樣品中抑菌劑含量測定異常（含量不足或品種不符）結果見表3，其余結果均符合規定。

表3 樣品中抑菌劑含量測定異常（含量不足或品種不符）結果Tab.3 Results of abnormal content determination（insufficient content or different varieties）of bacteriostatic agents in samples

3 討論

目前，抑菌劑含量測定方法多采用HPLC 法［3-8］、超高效液相色譜串聯質譜法［9］和氣相色譜法［10-12］。本研究中采用HPLC 法進行篩查，采用LC-MS/MS 法對篩查出的可疑樣品進行驗證，杜絕了誤判的可能，達到了快速、準確、可靠的檢測目的。流動相體系考察了乙腈-三乙胺溶液、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液等，結果以乙腈- 0.02 mol/L 乙酸銨溶液梯度洗脫時，基線平穩，色譜峰分離度良好，故選擇此溶液為流動相。根據測定結果，65 批樣品中6 種抑菌劑的含量均未超過2020年版《中國藥典（二部）》規定量的上限。但其中5批樣品未檢出藥品說明書中規定的抑菌劑，12 批樣品實際使用的抑菌劑品種與藥品說明書或處方規定不符。

個別藥品生產企業擴大范圍使用抑菌劑對羥基苯甲酸乙酯，中藥口服液通常呈酸性，杞菊地黃口服液的pH 值為3～4。目前廣泛使用的抑菌劑主要有苯甲酸（鈉）和山梨酸（鉀），對羥基苯甲酸酯類抑菌劑更適用于中性溶液，未批準用于杞菊地黃口服液，不僅達不到防腐、抑菌作用，還會危害患者的健康［13-15］。故建議新增相應檢驗方法，以加強監管，規范生產。選擇抑菌劑時，除考慮制劑pH 值的影響外，還應考慮制劑的長期穩定性，以及與輔料和包裝材料的相容性，最佳使用量應為保證產品的抑菌體系有效的最低使用量，同時濃度應低于對人體的有害濃度。