復方白頭翁灌腸液質量標準研究*

陳 平，羅曉梅，曾于樺，楊 強，張亞峰，張 鵬

（四川省遂寧市中心醫院，四川 遂寧 629000）

復方白頭翁灌腸液主要由白頭翁、黃柏、黃連、地榆、蒲公英、苦地丁等組方，具有清熱燥濕、解毒消癰、涼血止痢等功效［1］，主要用于治療潰瘍性結腸炎。方中，白頭翁為君藥，具有清熱解毒、涼血止痢功效；黃連清熱瀉火、燥濕厚腸，黃柏擅清下焦濕熱，共為臣藥，助白頭翁清熱解毒、燥濕治痢功效［2］。白頭翁皂苷B4是白頭翁的主要成分，具有抗炎、抗病毒、免疫調節等藥理學作用［3］；小檗堿為黃連、黃柏共有成分，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、流感病毒等均有抑制作用［4-5］。目前，尚缺乏復方白頭翁灌腸液的檢測標準，為加強其質量控制，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中白頭翁、黃連、黃柏、木香等中藥材進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定復方白頭翁灌腸液中白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿的含量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；XS- 205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬分之一）；KQ - 250DE 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

白頭翁皂苷B4對照品（批號為RFS-B02901907022），鹽酸小檗堿對照品（批號為RFS - Y03511811015），鹽酸黃柏堿對照品（批號為RDD - Y08602108016），去氫木香內酯對照品（批號為RFS - Q01601906013），純度均大于98%，均購自瑞芬思生物有限公司；白頭翁對照藥材（批號為121615-201603），黃連對照藥材（批號為121752 - 201801），黃柏對照藥材（批號為121510 -201807），木香對照藥材（批號為120921 - 202010），均購自中國食品藥品檢定研究院；復方白頭翁灌腸液（醫院自制，批號分別為20211101，20211103，20211109）；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

白頭翁［6-7］：取樣品（批號為20211109）10 mL，加正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并有機層，蒸干，加5 mL甲醇超聲使溶解，即得供試品溶液。取白頭翁皂苷B4對照品0.007 5 g，精密稱定，加甲醇定容至25 mL，制成質量濃度為0.3 mg/mL 的對照品溶液。取白頭翁對照藥材1.056 g，加甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得對照藥材溶液。按處方工藝制備缺白頭翁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，分別吸取上述溶液各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶2，V/V/V）為展開劑，室溫下展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，冷卻，日光下檢視。供試品溶液、白頭翁皂苷B4對照品溶液、白頭翁對照藥材溶液在薄層板上相應位置顯相同顏色的斑點，斑點比移值較好，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

1 - 7.供試品溶液 8 - 9.對照品溶液 10 - 11.對照藥材溶液 12 - 13.陰性對照品溶液A.白頭翁（日光） B.黃連（365 nm） C.黃柏（日光） D.木香（日光）圖1 薄層色譜圖1 - 7.Test solution 8 - 9.Reference solution 10 - 11.Reference medicinal material solution 12 - 13.Negative reference solutionA.Pulsatillae Radix（sunlight） B.Coptidis Rhizoma（365 nm） C.Phellodendri Chinensis Cortex（sunlight） D.Aucklandiae Radix（sunlight）Fig.1 TLC chromatograms

黃連［8-9］：取樣品（批號為20211109）10 mL，加熱蒸發至稠膏狀，加甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得供試品溶液。取鹽酸小檗堿對照品0.006 3 g，精密稱定，加甲醇定容至25 mL，制成質量濃度為0.252 mg/L的對照品溶液。取黃連對照藥材0.103 1 g，加甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得對照藥材溶液。按處方工藝制備缺黃連、黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，分別吸取上述溶液各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯- 異丙醇- 甲醇- 濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，置濃氨試液預飽和10 min的展開缸內室溫下展開，取出，晾干，于紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液、黃連對照藥材溶液在薄層板上相應位置顯相同顏色的斑點，斑點比移值較好，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

黃柏［10-11］：取樣品（批號為20211109）10 mL，加熱蒸發至稠膏狀，加1%醋酸甲醇10 mL，60 ℃超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得供試品溶液。取鹽酸黃柏堿對照品0.012 7 g，精密稱定，加甲醇定容至25 mL，制成質量濃度為5.080 mg/ L 的對照品溶液。取黃柏對照藥材0.104 5 g，加1%醋酸甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得對照藥材溶液。按處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，分別吸取上述溶液各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶2，V/V/V）下層有機溶液為展開劑，置濃氨試液飽和的展開缸內常溫展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視。供試品溶液、鹽酸黃柏堿對照品溶液、黃柏對照藥材溶液在薄層板上相應位置顯相同顏色的斑點，斑點比移值較好，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

木香［12-13］：取樣品（批號為20211109）10 mL，加三氯甲烷萃取2次，每次10 mL，合并有機相，蒸干，加5 mL甲醇超聲使溶解，即得供試品溶液。取去氫木香內酯對照品0.5 mg，加甲醇制成質量濃度為1 mg/mL 的溶液，即得對照品溶液。取木香對照藥材1.004 0 g，加甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，濾液濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。按處方工藝制備缺木香的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗，分別吸取上述溶液各4 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮（10∶3，V/V）為展開劑，常溫展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液、去氫木香內酯對照品溶液、木香對照藥材溶液在薄層板上相應位置顯相同顏色的斑點，斑點比移值較好，且陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 HPLC 法測定白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿的含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsustain C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g，30∶70，V/V，白頭翁皂苷B4），乙腈- 0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g，50∶50，V/V，鹽酸小檗堿）；檢測波長：205 nm（白頭翁皂苷B4），254 nm（鹽酸小檗堿）；柱溫：35 ℃（白頭翁皂苷B4），40 ℃（鹽酸小檗堿）；流速：1.0 mL/min；進樣量：15 μL。

2.2.2 溶液制備

取白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇超聲0.5 h 至完全溶解，配制成質量濃度分別為0.910 mg/mL 和0.31 mg/mL 的對照品溶液。取樣品10 mL，加正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并有機相，蒸干，殘渣加5 mL 甲醇超聲使溶解，即得供試品溶液Ⅰ；取樣品10 mL，加熱蒸發至稠膏狀，加甲醇10 mL，超聲0.5 h，濾過，取濾液，即得供試品溶液Ⅱ。按處方工藝分別制備缺白頭翁、黃連和黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2 項下3 種溶液各15 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果各色譜峰分離良好，峰形對稱，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

1.白頭翁皂苷B4 2.鹽酸小檗堿A1，A2.對照品溶液 B1，B2.供試品溶液 C1，C2.陰性對照品溶液（分別缺白頭翁、黃連和黃柏）圖2 高效液相色譜圖1.Pulchinenoside B4 2.Berberine hydrochlorideA1，A2.Reference solution B1，B2.Test solution C1，C2.Negative reference solution（lack of Pulsatillae Radix，Coptidis Rhizoma，and Phellodendri Chinensis Cortex，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.2.2項下白頭翁皂苷B4對照品溶液0.5，1，2，3，4，5 mL，分別置不同的5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲15 min，制成質量濃度分別為91.00，182.00，364.00，546.00，728.00，910.00 μg/mL的系列對照品溶液；精密吸取2.2.2項下鹽酸小檗堿對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲15 min，制成質量濃度分別為31.00，62.00，124.00，186.00，248.00，310.00 μg/ mL 的系列對照品溶液。分別按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y白=4 × 106X白+ 29 943（R2= 0.999 4，n= 6）和Y鹽=4×106X鹽+161 877（R2=0.999 5，n=6）。結果表明，白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿質量濃度分別在91.00～910.00 μg/mL 和31.00～310.00 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿對照品溶液（質量濃度分別為364.00，124.00 μg/mL）各15 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.45%和0.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20211109）樣品6份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定。結果白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿的平均含量分別為287 μg/ mL 和78.52 μg/ mL，RSD分別為0.27%和0.16%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為20211109）適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.35%和0.21%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20211109）9 份，各10 mL，分別加入白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿對照品溶液（質量濃度分別為2.931 0 mg / mL 和0.254 0 mg/ mL）0.5，1.0，1.5 mL，各3 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n = 9）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20211101，20211103，20211109）樣品，各3 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算樣品中白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿的含量。結果見表2。

表2 樣品中白頭翁皂苷B4和鹽酸小檗堿含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.2 Results of content determination of pulchinenoside B4 and berberine hydrochloride in samples（mg / mL，n = 3）

3 討論

3.1 TLC 條件選擇

黃連：參考2020 年版《中國藥典（一部）》黃連項下TLC 法，以環己烷- 乙酸乙酯- 異丙醇- 甲醇- 水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V/V）為展開體系，置濃氨試液預飽和20 min 的展開缸內展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果斑點位置、數量與《中國藥典》不符，原因可能為展開劑的組分和比例不適合供試品溶液的展開［8］。同時，考察展開體系苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V），乙酸丁酯-甲醇-異丙醇-水（10∶6∶3∶1.2，V/V/V/V），甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）對TLC法鑒別結果的影響，結果以甲苯- 乙酸乙酯- 異丙醇- 甲醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）為展開劑時，黃連的TLC 鑒別效果較好。鹽酸小檗堿偏堿性，在展開缸里加入濃氨試液改善斑點形狀，但氨水添加順序對黃連的TLC圖有極大影響，發現濃氨試液飽和10～30 min可明顯改善斑點的形狀，若飽和時間過長，斑點呈扁圓形甚至直接融合成直線［14］。同時，考察不同觀察方法（紫外光燈254 nm 和365 nm）及不同展距（7，8，9 cm）對TLC圖的影響，最終確定以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，濃氨試液飽和時間為10～30 min，展距為8 cm，紫外光燈（365 nm）下檢視的分離效果較好，主斑點比移值適宜，且斑點清晰。

白頭翁：參照2020 年版《中國藥典（一部）》白頭翁TLC 法制備供試品溶液，將復方白頭翁灌腸液旋干，加適量甲醇超聲，過濾，即得；并嘗試使用不同展開系統［15-17］對白頭翁進行TLC 鑒別，但常出現載樣量偏大、拖尾嚴重、白頭翁皂苷B4斑點幾乎在基線上，達不到分離要求。改用正丁醇為提取溶劑，直接提取復方白頭翁灌腸液，蒸干后加入甲醇充分溶解，作為供試品溶液，嘗試不同展開劑系統［氯仿- 甲醇- 水（7∶3∶0.5，V/V/V），正丁醇- 冰醋酸- 水（4∶1∶2，V/V/V）］，結果展開劑為后者時對照品溶液與供試品溶液色譜中白頭翁皂苷B4的斑點在一條直線上，斑點清晰，分離效果較好。故最終確定2.1項下白頭翁的TLC鑒別法。

3.2 HPLC 法指標成分選擇

方中，白頭翁具有較強的抗菌活性，可用于細菌性痢疾、感染性腹瀉、潰瘍性結腸炎等疾病的治療［18］。君藥白頭翁的主要活性成分白頭翁皂苷B4的抗炎、抗病毒效果顯著［19-20］；黃連、黃柏共有成分小檗堿具有抗菌、抗病毒等藥理作用［3］，用于治療急性腸胃炎、消化性潰瘍、腹瀉等多種細菌引起的消化系統疾病的療效顯著。故本研究中選擇白頭翁皂苷B4、鹽酸小檗堿作為指標性成分進行含量測定。

3.3 鹽酸小檗堿含量測定流動相選擇

2020 年版《中國藥典（一部）》黃連含量測定項下鹽酸小檗堿的流動相為乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（50∶50，V/V），每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調pH 值為4.0；黃柏含量測定項下鹽酸小檗堿的流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，V/V），每100 mL 加十二烷基磺酸鈉0.1 g。兩組流動相中均加入了十二烷基磺酸鈉，其陰離子可與被測組分離子結合，提高分離度，優化分析效果［21-22］。本研究中發現，在磷酸二氫鉀溶液中每100 mL 加十二烷基硫酸鈉0.4 g，十二烷基硫酸鈉需加熱攪拌才能完全溶解，但冷卻至常溫后溶液又變渾濁。故最終確定以乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL 加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g）作為流動相，檢測波長為254 nm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，在此色譜條件下，鹽酸小檗堿保留時間適宜，基線平穩無漂移，與雜質峰分離良好。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、結果準確可靠、重復性好，可用于復方白頭翁灌腸液的質量控制。