鹽酸羥考酮原料藥中元素雜質(zhì)控制方法研究*

田向斌，柯 靜，王文麗，張曉明

（甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070）

鹽酸羥考酮是一種強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥，是從生物堿蒂巴因中提取合成的阿片類藥物，臨床應(yīng)用廣泛［1-2］。鹽酸羥酮緩釋片主要作用于中樞神經(jīng)，起效快，維持時(shí)間長(zhǎng)，且不易產(chǎn)生不良反應(yīng)［3-5］。2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》［6］中采用重金屬檢查法測(cè)定鹽酸羥考酮中重金屬限量。重金屬限量檢測(cè)在線性范圍、準(zhǔn)確性、靈敏度、專屬性等方面均存在不足，多國(guó)藥典中提出元素雜質(zhì)控制的新標(biāo)準(zhǔn)和新方法［7-8］。人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）Q3D 中將元素分為三類，其中第一類元素砷、鎘、汞、鉛有明顯毒性，一般情況下在藥物的生產(chǎn)中限制使用或不用，但會(huì)以雜質(zhì)形式出現(xiàn)在原料中，且不易除掉［9］。本研究中采用微波消解法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用光譜法［石墨爐原子吸收光譜（GF-AAS）法和原子熒光光譜法］和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法對(duì)第一類元素及鹽酸羥考酮原料藥合成工藝中催化劑鈀元素進(jìn)行了分析，建立了鹽酸羥考酮原料藥中元素雜質(zhì)的控制方法［10-15］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICP - MS2030 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司）；Agilent 240ZAA型石墨爐原子吸收分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent公司）；2100AFS型雙通道原子熒光光度計(jì)（北京海光儀器有限公司）；MiliQ7000 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；Anton Paar MultiwavePRO 型微波樣品制備系統(tǒng)（奧地利Anton Paar 公司）；ME204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

硝酸（批號(hào)為190304106，含量為68.0%～70.0%），過(guò)氧化氫（批號(hào)為190106103，含量為30.0～32.0%），均為金屬- 氧化物- 半導(dǎo)體電路專用的特純?cè)噭?，?gòu)于蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；鹽酸（批號(hào)為20170406，含量為36.0%～38.0%），硼氫化鉀（批號(hào)為20170915），硝酸鎂（批號(hào)為20180909），均為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀（優(yōu)級(jí)純），磷酸二氫銨（分析純），硫脲（優(yōu)級(jí)純），抗壞血酸（優(yōu)級(jí)純），均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸羥考酮（批號(hào)分別為1708026-1，1708030-1，1708031-1，1708032-1，1708033-1，1810001），蒂巴因（批號(hào)分別為 201511011，201511012，201512013，201512014，201512015，201512016），均購(gòu)于甘肅普瑞制藥有限公司；ICP-MS Internal Std Mix（Agilent Technologies，質(zhì)量濃度為100 μg/ mL）；鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液、砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）、汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液、鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL，均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；鈀單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 微波消解條件

條件見(jiàn)表1。

表1 微波消解條件Tab.1 Conditions of microwave digestion

2.2 工作條件

2.2.1 光譜法

詳見(jiàn)表2。其中，鎘元素基體改進(jìn)劑為1%磷酸二氫銨+ 0.2%硝酸鎂（共進(jìn)10 μL）。砷元素和汞元素的負(fù)高壓均為270 V，載氣流速均為400 L/ min；采樣時(shí)間為15 s。

表2 光譜法工作條件Tab.2 Working conditions of the spectrometry

2.2.2 ICP-MS 法

碰撞池模式：KED；高頻功率：1.20 kW；采樣深度：5.0 mm；等離子體氣流速：8.0 L/ min；輔助氣流速：1.10 L/min；載氣流速：0.70 L/min。

2.3 溶液制備

2.3.1 光譜法

稀釋液：取適量硝酸和鹽酸溶液，用超純水稀釋成2%硝酸+0.5%鹽酸的稀釋液。

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密吸取鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用稀釋液稀釋成每1 mL 含鉛20 ng的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；精密吸取鈀單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用稀釋液稀釋成每1 mL 含鈀100 ng 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；精密吸取鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用稀釋液稀釋成每1 mL含鎘5 ng的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；分別精密吸取汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液、砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，置同一容量瓶中，用稀釋液稀釋成每1 mL 含汞200 ng、砷4 000 ng的混合貯備液。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取2.3.1項(xiàng)下鉛、鈀、鎘標(biāo)準(zhǔn)貯備液，以稀釋液為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液，由石墨爐原子吸收分光光度計(jì)自動(dòng)稀釋進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。取2.3.1項(xiàng)下汞、砷元素混合貯備液，用稀釋液稀釋成每1 mL分別含汞0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 ng，含砷2，4，8，16，32，48 ng的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

供試品溶液：取樣品0.5 g，精密稱定，置微波消解罐中，加入硝酸5 mL，過(guò)氧化氫溶液2 mL，置微波消解儀中，按消解程序?qū)悠废馔耆?，放冷，取出，置控溫電熱板上?30 ℃加熱使多余的酸揮發(fā)除盡，并持續(xù)濃縮至1～2 mL，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用稀釋液稀釋并定容。

空白溶液：同供試品溶液制備方法制備不加樣品的試劑空白溶液。

2.3.2 ICP-MS 法

貯備液：分別精密量取鉛、砷、鎘、鈀標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，用2.3.1項(xiàng)下稀釋液制成每1 mL 含4 000 ng的混合貯備液；精密量取汞單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2.3.1 項(xiàng)下稀釋液稀釋成每1 mL含汞1 000 ng的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取2.3.2項(xiàng)下混合貯備液和汞標(biāo)準(zhǔn)貯備液各適量，用2.3.1項(xiàng)下稀釋液稀釋成每1 mL 含鉛、鎘、砷、鈀元素2，10，20，30，40，50 ng，含汞1，2，4，6，8，12 ng的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液：同2.3.1項(xiàng)下。

空白溶液：同2.3.1項(xiàng)下。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：1）光譜法。取2.3.1項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.1項(xiàng)下工作條件，以稀釋液為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液，由石墨爐原子吸收分光光度計(jì)自動(dòng)稀釋并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，以各元素吸光度（Abs）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；按2.2.1項(xiàng)下工作條件，以稀釋液為空白，用原子熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，以相應(yīng)元素的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（If）、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2）LCP-MS法。取2.3.2項(xiàng)下系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2.2 項(xiàng)下工作條件，以各元素質(zhì)量濃度（C）為縱坐標(biāo)、信號(hào)強(qiáng)度（I）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test

檢測(cè)限和定量限：1）光譜法。取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定7 次，計(jì)算吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（δ），按3.3δ與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率（S）的比值計(jì)算檢測(cè)限；按10δ與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率的比值計(jì)算定量限［16］。2）ICP-MS 法。按取樣量0.5 g，按稀釋倍數(shù)25 倍計(jì)算，分別得方法檢測(cè)限和方法定量限。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 檢測(cè)限和定量限確定結(jié)果Tab.4 Determination results of LOD and LOQ

加樣回收試驗(yàn)：分別吸取鉛、鈀單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液各適量，用稀釋液制成每1 mL 含鉛1 000 ng、鈀2 000 ng的鉛、鈀元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取鹽酸羥考酮原料藥（批號(hào)為1810001）9 份，每份0.5 g，精密稱定，分別置微波消解罐中，加入硝酸5 mL、過(guò)氧化氫溶液2 mL，分別精密加入上述鉛、鈀元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.125，0.25，0.375 mL，各3 份，混勻，按2.3 項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液。取加樣供試品溶液和空白溶液，在相應(yīng)元素條件下用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 鉛和鈀元素GF-AAS法加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of the recovery test of lead and palladium by the GF-AAS method（n=3）

重復(fù)性試驗(yàn)：取鹽酸羥考酮原料藥（批號(hào)為1810001）6 份，每份0.5 g，精密稱定，分別置微波消解罐中，加入硝酸5 mL、過(guò)氧化氫溶液2 mL，分別精密加入加樣回收試驗(yàn)項(xiàng)下鉛、鈀元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。結(jié)果鉛和鈀元素的加標(biāo)濃度分別為10 ng/mL 和20 ng/mL，RSD分別為3.80%和2.10%（n=6）。

2.5 樣品元素雜質(zhì)測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對(duì)6個(gè)批次的鹽酸羥考酮原料藥和起始原料蒂巴因中鉛、砷、汞、鎘、鈀元素分別進(jìn)行光譜法和ICP-MS法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6和表7。

表6 鹽酸羥考酮原料藥中元素雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果（μg/g）Tab.6 Determination results of element impurities in the API of hydroxycodone hydrochloride（μg/g）

3 討論

3.1 元素雜質(zhì)控制種類選擇

藥品中的元素雜質(zhì)對(duì)藥品的安全性和有效性有顯著影響，特別是重金屬元素通常在人體難以代謝，易在體內(nèi)蓄積，影響健康。各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)元素雜質(zhì)的監(jiān)管日趨嚴(yán)格和規(guī)范［17-20］，元素雜質(zhì)的控制和分析是藥品研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)，但元素雜質(zhì)種類繁多，很難全部納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2020 年版《中國(guó)藥典（二部）》中，鹽酸羥考酮采用了重金屬檢查法對(duì)重金屬限度進(jìn)行控制，但方法專屬性不強(qiáng)、靈敏度低，無(wú)法對(duì)藥品中所有有害金屬雜質(zhì)進(jìn)行有效控制。

本研究中通過(guò)對(duì)鹽酸羥考酮原料藥及其合成起始原料蒂巴因中ICH Q3D 規(guī)定的4種第一類元素，以及作為催化劑使用的鈀元素進(jìn)行了綜合分析，其中鉛元素在兩者中均有檢出，且合成起始原料蒂巴因中的檢測(cè)結(jié)果高于鹽酸羥考酮原料藥，表明存在由原料引入鉛元素的風(fēng)險(xiǎn)，故需對(duì)鉛元素進(jìn)行檢測(cè)和控制。汞元素在合成起始原料和原料藥中均未檢出；砷元素在原料藥中未檢出；隔元素僅有1 批原料藥中檢出，但結(jié)果低于其定量限，故無(wú)需考慮將汞、砷、鎘元素雜質(zhì)列入原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。另外，鈀元素雜質(zhì)是作為原料合成工藝的催化劑，且有1批原料藥中檢出鈀，表明存在由生產(chǎn)工藝引入鈀元素的風(fēng)險(xiǎn)。為保證原料藥質(zhì)量的安全性，需將鉛、鈀元素列入原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。

3.2 元素雜質(zhì)控制限度制訂

ICH Q3D 中對(duì)鉛元素雜質(zhì)給出的最大日允許攝入量（PDE）為5 μg/d，鈀元素為100 μg/d。對(duì)原料藥的元素雜質(zhì)的允許濃度按ICH Q3D 中PDE 值和濃度限度互相轉(zhuǎn)換方法1進(jìn)行簡(jiǎn)化計(jì)算，按日劑量不超過(guò)10 g/d的最大量，鉛元素和鈀元素控制限度分別為0.5 μg/g 和10.0 μg/g。

3.3 元素雜質(zhì)控制方法選擇

原子吸收法和ICP-MS 法均是目前非常成熟的金屬雜質(zhì)的檢測(cè)方法。部分方法在建立時(shí)未經(jīng)過(guò)綜合研判，單純追求使用高精尖設(shè)備，但更高端的設(shè)備往往普及率低，價(jià)格昂貴，使用、維護(hù)成本高。對(duì)于鹽酸羥考酮原料藥中金屬雜質(zhì)的控制，本研究中建立了微波消解法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，分別使用GF-AAS法和ICP-MS法測(cè)定鉛、鈀元素，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明均能滿足2020年版《中國(guó)藥典》9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中的要求。GF-AAS法與ICP-MS法在測(cè)定鉛元素時(shí)具有同量級(jí)的線性范圍和檢測(cè)限等。GF - AAS 法測(cè)定鈀元素的檢測(cè)限高于ICP-MS法，但檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)低于制訂的控制限度。綜合考慮，GF-AAS法的儀器普及率、操作和使用、維護(hù)成本均優(yōu)于ICP-MS 法。故確定以GF-AAS 法作為鹽酸羥考酮原料藥元素雜質(zhì)的控制方法。