松蘿酸經HMGB1-RAGE信號通路治療膠原誘導性關節炎大鼠關節炎機制研究

潘曉藝 黃穎 張軍 徐暉 陸道敏 劉燦 凌益 安陽

【摘 要】目的：探討松蘿酸經高遷移率族蛋白B1（HMGB1）-晚期糖基化終產物受體（RAGE）信號通路治療膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠關節炎的機制。方法：選取SPF級5周齡Wistar雌鼠

54只，隨機分為空白對照組，模型對照組，松蘿酸低、中、高劑量組和羥氯喹組，每組9只。除空白對照組外，其余各組采用Ⅱ型膠原乳劑建立CIA模型。松蘿酸低、中、高劑量組分別給予2 mg·kg-1·d-1、

6 mg·kg-1·d-1、54 mg·kg-1·d-1松蘿酸灌胃，羥氯喹組給予36 mg·kg-1·d-1羥氯喹灌胃，空白對照組及模型對照組則予以等量生理鹽水灌胃。連續灌胃4周后，處死大鼠，收集血清，取滑膜組織，分別行HE染色病理檢測，ELISA法檢測白細胞介素-1β（IL-1β）、基質金屬蛋白酶（MMP）、血管內皮生長因子（VEGF）含量，Western blot法檢測HMGB1、RAGE mRNA表達水平；PCR法檢測HMGB1、RAGE蛋白表達量。結果：與模型對照組比較，松蘿酸中、高劑量組滑膜增生程度減低，炎性細胞浸潤減少，血清HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF表達顯著下降（P < 0.05），且HMGB1、RAGE蛋白活性、mRNA含量明顯降低（P < 0.05）。結論：松蘿酸能減少炎性細胞浸潤及滑膜細胞增殖，其機制可能與抑制HMGB-RAGE信號通路有關。

【關鍵詞】 類風濕關節炎；膠原誘導性關節炎；松蘿酸；HMGB1-RAGE信號通路；大鼠

Study on the Mechanism of Usnic Acid Treating Collagen Induced Arthritis in Rats Through HMGB1-RAGE Signal Pathway

PAN Xiao-yi，HUANG Ying，ZHANG Jun，XU Hui，LU Dao-min，LIU Can，LING Yi，AN Yang

【ABSTRACT】Objective：To investigate the mechanism of usnic acid in the treatment of collagen induced arthritis（CIA）in rats through HMGB1-RAGE signaling pathway.Methods：A total of 54 SPF grade five-week-old Wistar female mice were selected and randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium，and high dose groups of usnic acid，and a hydroxychloroquine group，with 9 mice in each group.Except the blank control group，the other groups used type Ⅱ collagen emulsion to establish CIA models.The low，medium，and high dose groups of usnic acid were given 2 mg·kg-1·d-1，6 mg·kg-1·d-1 and 54 mg·kg-1·d-1 usnic acid by gavage，while the hydroxychloroquine group was given 36 mg·kg-1·d-1 of hydroxychloroquine by gavage.The blank control group and the model control group were given equal amounts of physiological saline by gavage.After continuous gavage for four weeks，rats were euthanized，serum was collected，synovial tissue was taken，and HE staining and pathological detection were performed.ELISA was used to detect the content of IL-1β，MMP and VEGF，Western blot was used to detect the expression levels of HMGB1 and RAGE mRNA，and PCR method was used to detect the expression levels of HMGB1 and RAGE proteins.Results：Compared with the model control group，the medium and high-dose groups of usnic acid showed a decrease in synovial hyperplasia，inflammatory cell infiltration，and the expression of HMGB1，IL-1β，MMP and VEGF in serum significantly reduced（P < 0.05），and the protein activity of HMGB1 and RAGE，and the content of mRNA significantly reduced（P < 0.05）.Conclusion：Usnic acid can reduce inflammatory cell infiltration and synovial cell proliferation，and its mechanism may be related to the inhibition of the HMGB-RAGE signaling pathway.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;collagen induced arthritis;usnic acid;HMGB1-RAGE signaling pathway;rats

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種

臨床常見的以關節慢性炎性反應，關節滑膜增生及血管翳形成為特點的自身免疫性疾病，屬中醫學“痹病”“尪痹”等范疇。研究發現，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）在RA疾病進展中有著重要的促進作用，在RA患者滑膜組織、滑液甚至血清中，HMGB1表達水平顯著升高［1-2］，且與RA患者病情活動度呈正相關［3］。松蘿為侗族醫藥，有除濕通絡、清熱解毒之功，主要用于治療痹病。松蘿酸為松蘿干燥地衣提取物，分子式為C18H16O7，現代研究證實，松蘿酸具有抗炎、鎮痛、抑制血管生成、減少炎性滲出等作用［4］。課題組在前期的臨床研究中證實，松蘿的組方制劑可以有效改善RA患者的臨床癥狀和體征［5］，降低膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠HMGB1 mRNA的表達量，抑制HMGB1的蛋白表達［6］。松蘿酸經HMGB1-晚期糖基化終產物受體（RAGE）信號通路治療RA研究未見文獻報道。

因此，本實驗擬通過建立CIA大鼠模型，探討松蘿酸經HMGB1-RAGE信號通路調控CIA大鼠關節滑膜炎癥的可能作用機制，為民族醫藥治療RA提供新的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選取SPF級5周齡Wistar雌性大鼠54只，體質量150～180 g，購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2020-0018，喂養環境室溫20～25 ℃、濕度70%左右，自由進食、自由飲水，適應環境1周后開始實驗。

1.2 實驗儀器 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號DHG 9203A）；PCR儀（東勝創新生物科技有限公司，型號EDC-810）；全自動酶標儀（美國Thermo scientific，型號Multiskan MK3）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠，型號DYCZ-40）；微型高速離心機（美國Labnet，型號C2500-R-230V）；電熱恒溫培養箱（日本ASONE，型號ICV-450）；離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號HI650）；輪轉式病理切片機（德國Leica，型號RM 2016）；生物顯微鏡（奧林巴斯，型號BX53）。

1.3 實驗藥品與試劑 松蘿酸（CAS125-46-2，Solarbio，批號IU0130）；羥氯喹（Solarbio，批號IH0720）；磷酸酶抑制劑（碧云天，批號S1873）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，批號P0010），RIPA裂解液（碧云天，批號P0013B）；HMGB1檢測試劑盒（武漢優爾生商貿有限公司，批號SEA399Ra）；基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）檢測試劑盒（武漢優爾生商貿有限公司，批號SEA097Ra）；白細胞介素-1β（IL-1β）

檢測試劑盒（欣博盛，批號ERC007.48）；血管內皮生長因子（VEGF）試劑盒（Elabscience，批號E-EL-R2603c）；蘇木素（Sigma，批號H9627）；抗β-actin抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號BM0627）；抗HMGB1抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號10829-1-AP）；抗RAGE抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號bs-4999R）。

2 方 法

2.1 動物模型制備 按隨機數字表進行編號，將54只Wistar大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，松蘿酸低、中、高劑量組和羥氯喹組，每組

9只。模型制備方式為將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol·L-1的醋酸中，攪拌溶解，配成2 mg·mL-1溶液，置4 ℃冰箱過夜。與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化配制成Ⅱ型膠原乳劑，分別于大鼠尾根部多點皮內注射0.1 mL致炎，復制穩定的CIA大鼠模型［7］。模型制備成功評價：采用關節炎評分法，即模型制備成功的大鼠趾端至踝關節紅腫，關節炎癥評分 >

4分［8］。

2.2 給藥劑量 根據課題組前期的藥代學研究結果，本研究給藥劑量松蘿酸低、中、高劑量組分別為2 mg·kg-1·d-1、6 mg·kg-1·d-1、54 mg·kg-1·d-1。

羥氯喹成人用量400 mg·d-1，參照60 kg成人與動物藥物劑量換算系數表［9］，大鼠與人的對應換算系數為W = 5.4，羥氯喹組給予羥氯喹

36 mg·kg-1·d-1灌胃，空白對照組與模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 樣品采集 灌胃4周后麻醉處死大鼠，股動脈取血4～6 mL，室溫靜置30 min后，置于離心機以3000 r·min-1離心15 min，離心半徑10 cm，取上清，分裝于Ep管內，標記后保存于-80 ℃超低溫保存箱內待測。沿大鼠膝關節側面髕骨外緣縱行切開，鈍性分離關節囊的纖維層和滑膜層，無菌剝離滑膜組織，快速置于Ep管中，液氮保存待測。

2.4 酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF水平 解凍血清，按照試劑盒設空白孔、標準孔、待測樣品孔，分別加樣，36 ℃孵育90 min，洗板5次，加入酶標試劑，36 ℃反應，溫育1 h，洗板5次，加入TMB

100 μL，覆膜36 ℃避光，溫育15 min，后加入終止液，測量OD值，進行計算。

2.5 逆轉錄熒光實時定量（RT-PCR）法檢測大鼠膝關節滑膜HMGB1、RAGE mRNA表達水平 提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，反應條件：50 ℃?2 min，95 ℃10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環。每個樣本3個副孔，重復3次。引物由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司合成，引物設計見表1。

2.6 蛋白免疫印跡（WB）法檢測HMGB1、RAGE蛋白表達量 取大鼠滑膜組織于勻漿器進行研磨、裂解，離心，取上清，即為大鼠滑膜蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒進行蛋白定量，經水浴、SDS-

PAGE電泳后轉膜至PVDF膜，封閉1 h，一抗4 ℃

過夜，反復洗膜后孵育，ECL化學發光試劑盒顯色，

掃描膠片，用圖像分析測定各條帶吸光度（A）值作定量分析。

2.7 關節滑膜病理形態學觀察 取關節滑膜、軟骨組織，4%多聚甲醛溶液，石蠟包埋，常規HE和膠原纖維染色。顯微鏡下觀察滑膜組織的炎性細胞浸潤以及血管翳形成情況，圖像分析系統分析結果。

2.8 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以表示，采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組大鼠血清中HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF含量比較 與空白對照組比較，模型對照組，松蘿酸低、中、高劑量組，羥氯喹組的HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF含量均升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿酸中、高劑量組及羥氯喹組HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF含量均降低（P < 0.05）；與羥氯喹組比較，松蘿酸低劑量組HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF含量升高（P < 0.05）。見表2。

3.2 各組大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE mRNA表達比較 與空白對照組比較，模型對照組，松蘿酸低、中、高劑量組，羥氯喹組大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE mRNA表達顯著增加（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿酸中、高劑量組及羥氯喹組HMGB1、IL-1β、MMP、VEGF mRNA表達減少（P < 0.05）；與羥氯喹組比較，松蘿酸低劑量組HMGB1、RAGE mRNA表達差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3.3 各組大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE蛋白表達比較 與空白對照組比較，模型對照組，松蘿酸低、中、高劑量組，羥氯喹組大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE蛋白表達顯著增加（P < 0.05）；與模型對照組比較，松蘿酸中、高劑量組及羥氯喹組HMGB1、RAGE蛋白表達減少（P < 0.05）；與羥氯喹組比較，松蘿酸低劑量組HMGB1、RAGE蛋白表達增多（P < 0.05）。見圖1，表4。

3.4 各組大鼠關節滑膜病理形態學觀察 除空白對照組外，其余各組可見明顯炎性細胞浸潤及血管翳的形成，與模型對照組比較，松蘿酸中、高劑量組滑膜增生程度減低，炎性細胞浸潤減少。見圖2。

4 討 論

RA屬中醫學“痹病”范疇。《素問·痹論篇》記載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”在侗族醫學中，RA屬“風濕痛”范疇，多因外感風、寒、濕、熱等邪，致使脈道不通、氣血水津代謝異常，機體蘊生“邪熱”，疼痛乃邪熱蘊阻關節之外象。侗醫名家吳定元所著《草木春秋》中記載：“筋痛拘急者，血氣熱也……。”對風濕痛的發病特征進行了描述，并提出“趕邪、消水”的治法，認為有邪當驅趕，腫脹宜消水。用藥方面，侗醫學認為“藥有氣無味者為陽，主表散、上升，有味無氣者為陰，主里、下降，清淡者利水，有毛有刺者追風”“邪氣犯于表，水濕停于內，用藥以升散，有如提壺揭蓋，熱氣上升、水液自流”，體現了陰陽協調、不分不離的思想。侗藥松蘿性味甘、平，有氣無味而屬陽，生于樹顛而下垂，位陽兼有陰的屬性，陰陽一體，表里均可，有除濕通絡、清熱解毒之功，可治風濕痹痛、跌打損傷。

RA發病錯綜復雜，病因及發病機制尚不清楚，主要病理改變為滑膜增生，伴隨著多種細胞因子異常分泌。HMGB1-RAGE信號通路在RA發生、發展過程中起著重要作用。HMGBl是一種廣泛表達、高同源性、高度保守的低分子量非組蛋白核蛋

白［10-13］。在機體受到外源性或內源性炎癥刺激，或細胞凋亡、壞死以及免疫細胞活化等情況下，位于細胞核內的HMGB1可被釋放至細胞核外。IL-1β作為促炎因子在RA的滑膜增生及病程進展中十分重要，可促進免疫細胞的浸潤及MMP的釋放，是導致炎癥產生和關節破壞的關鍵因子［14］。RAGE是免疫球蛋白超家族中的一員，作為一種膜配體蛋白，已經證實在多種慢性炎癥性疾病中表達增加并發揮關鍵性作用［15］。當配體作用于RAGE后，可以激活信號通路引起下游的一系列反應，在RAGE激活的眾多配體中，HMGB1是親和力最高的一種。在HMGB-RAGE信號通路中，一方面，HMGB1通過與上游致炎因子IL-1β相互作用形成正反饋［16］，使炎癥反應得以維持；另一方面，RA患者滑膜組織中RAGE表達上調［17］，HMGB1與RAGE相結合后，能誘導VEGF［18］，以及下游致炎因子MMP［19］、IL-1β分泌，促進炎癥發生，引起血管翳的形成，最終導致關節破壞。因此，本研究檢測了松蘿酸對CIA大鼠血清以及關節滑膜HMGB1-RAGE信號通路的影響，結果顯示，松蘿酸能有效降低CIA大鼠血清及滑膜HMGB1、RAGE蛋白的表達，說明松蘿酸能抑制HMGB1-RAGE信號通路和相關炎癥因子的表達，以及血管翳的形成，從而起到預防骨破壞，保護關節的

作用。

綜上所述，松蘿酸能降低CIA大鼠關節炎癥狀及血清中炎性因子表達，抑制滑膜增生及炎性細胞浸潤，其作用機制可能與HMGB1-RAGE信號通路有關，但是否存在其他作用機制，仍待進一步研究。

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收稿日期：2023-05-17；修回日期：2023-06-22