HPLC法測定粿條中的脫氫乙酸

郭張虹 張楊 陳銀海

摘 要：目的：建立一種測定粿條中脫氫乙酸的高效液相色譜方法。方法：在樣品中加入水、硫酸鋅溶液，用氫氧化鈉溶液調節pH值，搖勻，超聲提取后加水定容并高速離心，取適量上清液過濾，用高效液相色譜儀測定，檢測波長293 nm。結果：在流動相設定為0.02 mol·L-1乙酸銨（pH值調節至8.0）∶甲醇=90∶10的條件下，脫氫乙酸的峰形對稱、無拖尾現象；脫氫乙酸響應強度與濃度（1～200 μg·mL-1）之間呈現良好的線性關系，線性相關性系數R2=0.999 98。測定的加標回收率為84.3%～106.0%，相對標準偏差為2.37%～2.90%。結論：該方法處理過程簡便、準確度高，具有良好的重現性，能夠準確測定粿條中脫氫乙酸的含量，易在基層檢測機構推廣，具有實際應用價值。

關鍵詞：高效液相色譜；粿條；脫氫乙酸

Determination of Dehydroacetic Acid in Rice Noodles by HPLC

GUO Zhanghong， ZHANG Yang， CHEN Yinhai

（Center for Disease Control and Prevention of Shantou City， Shantou 515041， China）

Abstract： Objective： This paper aims to establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of dehydroacetic acid in rice noodles. Method： The samples were added with water， zinc sulfate solution and then adjust pH with sodium hydroxide solution， shake well before ultrasonic extraction， finally the samples were added with water to a constant volume and then centrifuged at a high speed. The supernatant was filtered and then determined by HPLC at 293 nm. Result： Under the condition of mobile phase 0.02 mol·L-1 ammonium acetate∶methanol=90∶10 and the pH value of ammonium acetate adjusted to 8.0， the peak shape of dehydroacetic acid is symmetrical without trailing phenomenon. Within the concentration range of 1～200 μg·mL-1， the linear relationship between the response strength and the concentration of dehydroacetic acid was good， and the linear correlation coefficient of the target substance was 0.999 98. The recovery rates of the samples were 84.3%～106.0%， and the relative standard deviations were 2.37%～2.90%. Conclusion： The method has simple and convenient operation， high accuracy and good reproducibility， and is suitable for the accurate determination of dehydroacetic acid in rice noodles， which is easily to promoted in grass-roots testing institutions and has practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; rice noodles; dehydroacetic acid

脫氫乙酸是一種廣譜高效的防腐劑，能殺滅微生物或抑制其繁殖以達到防腐效果，可減緩食品變質，降低經濟損失[1]。脫氫乙酸及其鈉鹽在世界衛生組織化學物毒性分級標準中屬于低毒級別，對人體健康存在潛在威脅[2]，因此我國食品安全國家標準規定了脫氫乙酸及其鈉鹽在食品中的使用范圍和最大使用量[3]。盡管有明確規定，但部分食品生產商為了能延長食品保鮮保質時間、追求經濟效益最大化，依然會超范圍或超劑量使用脫氫乙酸，危害人體健康[4-5]。粿條是潮汕地區的傳統特色小吃，深受大眾喜愛，含有碳水化合物和蛋白質等豐富的營養成分，極易發生腐敗變質，商家為了延長粿條的保質期和保鮮期會添加脫氫乙酸，因此需要對粿條中脫氫乙酸含量進行監測，為消費者的食品安全提供保障。

目前食品中脫氫乙酸的檢測方法主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[6]、氣相色譜法[7]、高效液相串聯質譜法[8]等，其中HPLC法能實現對脫氫乙酸的定量分析，且易在基層檢測機構中推廣。因此，本文以汕頭市售粿條為樣品，利用HPLC法簡單快捷檢測脫氫乙酸，為今后高效快速檢測粿條或類似樣品中的脫氫乙酸提供較強的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：粿條，購自汕頭本地市場。

試劑：脫氫乙酸標準品，CDAA-263002-1g，購自上海安譜公司；硫酸鋅溶液（120 g·L-1）：稱取120 g硫酸鋅，用水稀釋至1 L；氫氧化鈉溶液（200 g·L-1）：稱取200 g氫氧化鈉，用水稀釋至1 L；乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，用水稀釋至1 L；甲醇：色譜純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配置DAD檢測器和OpenLAB工作站）；安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；UW220H電子天平，日本島津科學儀器公司；潔康多功能超聲波清洗機；梅特勒托利多pH計；H1850R臺式冷凍離心機，湖南湘儀公司；0.22 μm針式水相濾膜，上海安譜公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的建立

準確稱取脫氫乙酸標準品0.1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用10 mL氫氧化鈉溶液溶解，并用水定容至刻度線得到脫氫乙酸標準儲備液（1.0 mg·mL-1）。分別準確吸取脫氫乙酸標準儲備液0.1 mL、1.0 mL、5.0 mL、10 mL和20 mL，加入100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度線，配制成系列濃度分別為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標準工作液。

1.3.2 儀器條件

本實驗選用安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱；流動相：0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90∶10；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：293 nm。

1.3.3 樣品前處理

用高速均質器均質樣品，稱取約5 g（精確至0.001 g）樣品置于50 mL離心管中，依次加入10 mL水和5 mL硫酸鋅溶液，用氫氧化鈉溶液將樣品的pH值調節為7～8，搖勻，超聲提取20 min，加水定容至50 mL，搖勻，以10 000 r·min-1離心5 min，取適量上清液經0.22 μm水相濾膜過濾后供高效液相色譜儀測定。

1.3.4 流動相pH值的調節

用氫氧化鈉溶液將流動相乙酸銨溶液的pH值調節至7.5、8.0、8.5共3個水平，與未調節pH值生成的峰形進行比較，確定合適的流動相pH值。

1.3.5 精密度和準確度

選用基質空白粿條樣品作為本底，同一樣品設置3份，添加不同濃度的標準溶液，形成3個不同含量的加標水平，按照前處理方法及上機條件進行測定，檢測脫氫乙酸的含量。每個濃度做7組平行實驗，測定并計算平均回收率和相對標準偏差，從而考察該方法的精密度和準確度。

2 結果與分析

2.1 流動相pH值對脫氫乙酸峰形的影響

由圖1可知，沒有調節流動相pH值時，目標峰拖尾、峰形不對稱，不利于定量分析。將流動相pH值調節至7.5時，峰形有較大改善，拖尾現象也大幅減緩。繼續調節流動相pH值至8.0，此時峰形良好，峰尖銳且對稱，基本無拖尾現象，能夠準確對脫氫乙酸進行定量分析。當流動相pH值繼續調節至8.5時，能夠看出與pH=8.0時的峰形相比并無顯著差別。以上結果表明，該實驗中流動相pH值對脫氫乙酸的峰形影響很大，在一定范圍內，隨著pH值的升高，峰形越好，拖尾現象越不明顯。當流動相pH值達到8.0～8.5時，峰形良好，繼續升高流動相pH值，峰形無顯著變化，考慮保護色譜柱的原則，該實驗選擇流動相pH=8.0作為最佳實驗條件。

2.2 脫氫乙酸標準曲線

將1.3.1配制的脫氫乙酸系列標準工作液按照1.3.2的實驗條件上機測定，得到線性回歸方程為Y=30.705 52X+3.980 04，其線性相關性系數R2為0.999 98，脫氫乙酸峰面積（響應值）與濃度在1～200 μg·mL-1下呈現良好的線性關系。

2.3 方法精密度和準確度

在基質空白粿條樣品（本底值為0）中分別添加0.30 g·kg-1、0.60 g·kg-1、0.80 g·kg-1的脫氫乙酸標準物質，將3組處理好的不同水平的加標粿條樣品溶液在上述實驗條件下依次上機測定脫氫乙酸含量，根據結果計算平均回收率以及相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表1可知，在該實驗條件下測定粿條中脫氫乙酸的加標回收率為84.3%～106.0%，相對標準偏差為2.37%～2.90%，滿足定量分析的要求，說明此方法準確度高、重復性好、可信度高。

2.4 樣品分析

在汕頭當地市場隨機抽取了280份新鮮粿條，應用該方法檢測脫氫乙酸含量。其中，250份檢出有脫氫乙酸，檢出率接近90%，說明本地粿條中普遍添加脫氫乙酸。

3 結論與討論

本實驗探討了利用HPLC法檢測粿條中脫氫乙酸的可行性。實驗結果表明，在流動相設為0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=90∶10，調節流動相pH值至8.0時，能有效分離脫氫乙酸與其他干擾峰，改善脫氫乙酸的峰形，緩解拖尾現象，說明流動相pH值對脫氫乙酸的峰形有重要影響。脫氫乙酸解離常數（pKa）為5.4[9]，流動相的理論pH值大于pKa值+2或小于pKa值-2時能以分子形式或離子形式穩定存在，因此實驗時可根據樣品種類不同調節脫氫乙酸流動相的pH值為8.0～8.5，從而獲得良好的分析效果。對粿條進行的加標回收試驗，得到的加標回收率為84.3%～106.0%，相對標準偏差為2.37%～2.90%，說明此方法具有一定可操作性，可準確測定粿條樣品中脫氫乙酸的含量。

汕頭市售粿條脫氫乙酸的檢出率高，脫氫乙酸添加情況普遍，相關食品安全部門應加強監管，確保防腐劑的適量、科學添加，為這一傳統食品的健康發展提供強有力的支撐，保障消費者的食品安全。

參考文獻

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