羊口蹄疫病毒·羊口瘡病毒和山羊痘病毒多重PCR檢測方法的建立及應用

潘 永,楊 莉,李 婷,莫本田,李 剛,趙 濱,唐遠江,楊粵黔,孫啟躍,徐景峨

(貴州省農業科學院畜牧獸醫研究所,貴州貴陽 550005)

近年來,在貴州省大力推動羊產業高質量發展的背景下,羊存欄數截至2022年3月已突破390萬只。隨著養殖業的發展,養殖規模不斷擴大,疾病防控壓力也日益增大,特別是羊病毒性疾病,因其傳播快,致死率高,對羊養殖業發展構成嚴重威脅。羊口蹄疫、羊口瘡和山羊痘是分別由口蹄疫病毒、羊口瘡病毒和山羊痘病毒引發的疫病,引種、免疫失敗、新變異病毒株是感染上述病毒的常見因素[1-3]。由于3種疾病在臨床上有類似的特征,加之混合感染存在,給臨床診斷造成困難。因此,快速鑒別診斷對防控上述3種羊病具有重要意義。

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)、羊口瘡(Contagious ecthyma,CE)和山羊痘(Goat pox,GTP)疫病在臨床上存在類似癥狀。口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,俗稱“口瘡”。家養或野生偶蹄動物為該病毒的易感動物,臨床表現為唇、舌面、內面、齒齦、臉頰部黏膜、四肢下端和乳房處等無毛部位形成水皰,水皰破潰后形成紅色潰爛,嚴重時蹄殼脫落,導致動物跛行[4]。羊口瘡是由羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起的一種接觸性、嗜上皮性傳染病,可通過接觸傳播。山羊、綿羊、鹿科及駱駝科等其他反芻類動物為該病的易感動物,臨床表現為口、舌、唇、乳房和鼻鏡等皮膚部位形成膿皰、水泡和結痂[5]。山羊痘是由山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)引起的羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,臨床表現為發熱、結膜炎、鼻炎、過度流涎、皮膚黏膜發生皰疹和丘疹病變[6]。隨著養羊業的迅速發展,羊病的種類也開始增多且難以控制。另外,還存在多種病毒混合感染的現象,如顏新敏等[7]報道我國存在GTPV、ORFV及山羊傳染性胸膜肺炎混合感染羊的病例。

通過文獻查新發現,目前尚缺乏同時針對FMDV、ORFV和GTPV的快速檢測方法。鑒于傳統檢測方法在檢測混合感染病例時費時費力且容易誤診,現急需建立一種同時針對FMDV、ORFV和GTPV的快速鑒別診斷方法。筆者旨在利用PCR技術,建立可同時檢測FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,以期為未來流行病學調查和疾病防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料研究所涉及的ORFV、GTPV、FMDV疫苗株、藍舌病滅活病毒和小反芻獸疫病毒疫苗株、魏氏梭菌、羊結核桿菌和山羊支原體樣品均由實驗室保存。臨床樣品包括132份抗凝血和8份已鑒定的羊口瘡陽性痂皮組織,于2021年12月至2022年11月采集自貴州地區各規模化養羊場。

1.2 主要試劑和儀器設備核酸提取試劑盒DNA/RNA Extraction Kit、膠回收試劑盒FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit、質粒提取試劑盒RapidLyse Plasmid Mini Kit、反轉錄試劑盒HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶混合物2 × AceTaqMaster Mix(Dye Plus)、基因克隆載體ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit和DH5α 化學感受態細胞均為諾維贊產品;DL2000 DNA Marker為天根公司產品;PCR儀為BIO-RAD產品;凝膠電泳儀為北京六一公司產品。

1.3 引物設計下載NCBI中已上傳的不同血清型FMDV全基因序列、ORFV全基因序列和GTPV全基因序列,利用clustlW軟件對同一病毒不同血清型基因序列進行多序列比對,在保守性高的區域設計引物并由生工生物工程股份有限公司合成。引物信息及預擴增目的片段大小見表1。

表1 引物序列Table 1 Information of primer sequences used

1.4 核酸提取病毒樣品和待檢臨床樣品核酸的提取均使用DNA/RNA提取試劑盒,DNA樣品保存于-20 ℃,RNA樣品隨即進行反轉錄,所獲cDNA產物于-20 ℃保存,剩余RNA 于-80 ℃保存。

1.5 目的片段的擴增及克隆分別以FMDV、ORFV和 GTPV病毒樣品DNA/cDNA為模板,利用合成的引物進行PCR擴增。反應體系為2 × AceTaqMaster Mix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,DNA/cDNA模板2.0 μL,最后ddH2O補足至25 μL。反應程序為95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30個循環;72 ℃ 8 min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收并純化。參照諾維贊ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit試劑盒方法分別將回收產物與載體連接,轉化至DH5α 化學感受態細胞,挑取重組子進行測序驗證。將陽性重組質粒分別命名為pFMDV、pORFV和pGTPV,測定各質粒濃度并計算拷貝數。

1.6 多重PCR反應條件的優化以重組質粒pFMDV、pORFV和pGTPV為模板,對反應體系中的模板和引物用量以及反應程序中的退火溫度進行優化,以ddH2O作為陰性對照模板,通過觀察瓊脂糖凝膠電泳結果,確定多重PCR的最佳反應體系和條件。

1.7 特異性試驗在已提取獲得DNA/cDNA模板的基礎上,ddH2O作為陰性對照模板,pFMDV、pORFV和pGTPV質粒作為陽性對照,利用優化后的多重PCR方法分別對藍舌病病毒、小反芻獸疫病毒、魏氏梭菌、羊結核桿菌和山羊支原體進行檢測,以判斷該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗將pFMDV、pORFV和pGTPV質粒稀釋至同一拷貝數量級并等比例混合,以10倍梯度稀釋混合物并作為模板,檢測多重PCR方法的最低檢測限,ddH2O作為陰性對照模板。

1.9 重復性試驗將pFMDV、pORFV、pGTPV混合物等比例混合并作為模板,通過多重PCR反應方法檢測重復性,重復試驗3次。分別將FMDV疫苗株、ORFV和GTPV病原分離物混合后勻漿,提取總RNA和總DNA,總RNA隨即反轉錄為cDNA,以cDNA和總DNA混合物為模板,通過多重PCR反應方法檢測重復性,重復試驗3次。

1.10 臨床樣品的檢測所檢測臨床樣品包括采集的132份抗凝血、8份陽性羊口瘡痂皮病料按照100 μL病毒細胞培養上清和200 μL陰性全血混合分別制備3份ORFV模擬樣品和1份GTPV模擬樣品,將FMDV疫苗株10倍稀釋后與200 μL陰性全血混合制備1份FMDV模擬樣品,將3種病毒液等量混合后取100 μL和200 μL陰性全血制備2份混合型模擬樣品。提取樣品核酸用該試驗建立的多重PCR與常規PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 FMDV、ORFV、GTPV三重PCR反應建立與優化通過對引物和模板用量以及退火溫度的優化,確定了該多重PCR最佳反應體系為2 × AceTaqMaster Mix 12.5 μL,FMDV上下游引物終濃度200 nmol/L,ORFV引物上下游引物終濃度400 nmol/L,GTPV上下游引物終濃度200 nmol/L,質粒、cDNA/DNA模板均為1.5 μL,ddH2O補足至25 μL。

為明確多重PCR最佳反應程序,在最佳反應體系確定的基礎上,對退火溫度進行梯度優化處理,瓊脂糖凝膠電泳以及測序結果顯示,54～58 ℃均可同時擴增出3條大小正確的目的條帶,當退火溫度為57 ℃時,目的片段產量較高、引物二聚體較少(圖1)。結果表明,57 ℃可作為反應程序的最佳退火溫度,PCR最佳反應程序為95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共30個循環;72 ℃ 8 min。

注:M.DL 2 000 DNA 相對分子質量標準;1.53.0 ℃;2.53.3 ℃;3.54.0 ℃;4.54.9 ℃;5.56.1 ℃;6.57.0 ℃;7.57.6 ℃;8.58.0 ℃;9.陰性對照。Note:M.DL 2 000 DNA marker;1.53.0 ℃;2.53.3 ℃;3.54.0 ℃;4.54.9 ℃;5.56.1 ℃;6.57.0 ℃;7.57.6 ℃;8.58.0 ℃;9.Negative control.圖1 多重PCR退火溫度優化Fig.1 Optimization of multiplex PCR annealing temperature

利用優化后的多重PCR反應體系及條件檢測質粒pFMDV、pORFV和pGTPV單一或等比例混合模板,以模擬7種陽性檢測結果。瓊脂糖凝膠電泳以及測序結果顯示,該法檢測單一或混合質粒模板,目的條帶類型及大小均與預期相符(圖2)。結果表明,該法可正確檢測出FMDV、ORFV和GTPV的單一或混合感染。

注:M.DL 2 000 DNA 相對分子質量標準;1.pFMDV、pORFV、pGTPV混合;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.pFMDV、pORFV混合;6.pFMDV、pGTPV混合;7.pORFV、pGTPV混合;8.陰性對照。Note:M.DL 2 000 DNA marker;1.Mixtures of pFMDV,pORFV and pGTPV;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.Mixtures of pFMDV and pORFV;6.Mixtures of pFMDV and pGTPV;7.Mixtures of pORFV and pGTPV;8.Negative control.圖2 單一或混合質粒模板的多重PCR檢測Fig.2 Multiplex PCR detection of single or mixed plasmid templates

2.2 特異性試驗通過建立的多重PCR方法檢測5種非FMDV、ORFV和GTPV羊源病原體,以檢驗該法的特異性。結果顯示,與pFMDV、pORFV和pGTPV作為模板的陽性對照相比,5種羊源病原體無預擴增條帶(圖3)。結果表明,利用該法檢測FMDV、ORFV和GTPV,特異性較好。

注:M.DL 2 000 DNA 相對分子質量標準;1.pFMDV、pORFV、pGTPV混合;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.藍舌病病毒;6.小反芻獸疫病毒;7.魏氏梭菌;8.羊結核桿菌;9.山羊支原體;10.陰性對照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1.pFMDV,pORFV,pGTPV mixed;2.pFMDV;3.pORFV;4.pGTPV;5.BTV;6.PPRV;7.Clostridium weisseri;8.M.tuberculosis;9.Mycoplasma capricolum;10.Negative control.圖3 多重PCR檢測不同羊常見病原的特異性試驗Fig.3 Multiplex PCR detection of common pathogens in different sheep

2.3 敏感性試驗為檢測多重PCR方法對模板的最低檢測限,對pFMDV、pORFV和pGTPV不同數量級拷貝數模板進行多重PCR擴增(圖4)。結果顯示,當pFMDV和pGTPV數量級為103～108拷貝/μL,pORFV數量級為104～108拷貝/μL時均可擴增出與預期大小相符的目的條帶。結果表明,該法對pFMDV和pGTPV最低檢測數量級為103拷貝/μL,對pORFV則為104拷貝/μL。

注:M.DL 2 000 DNA 相對分子質量標準;1～8分別為108～101拷貝/μL的pFMDV、pORFV、pGTPV混合物;9.陰性對照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1-8.The pFMDV,pORFV and pGTPV mixtures are available at concentrations of 108-101 copies per microliter;9.Negative control.圖4 多重PCR敏感性試驗Fig.4 Susceptibility test for multiplex PCR

2.4 重復性試驗通過對重組質粒的混合物以及FMDV疫苗株、ORFV和GTPV病原混合物進行多重PCR檢測,檢驗該法的重復性(圖5)。瓊脂糖凝膠電泳以及測序結果顯示,該法對重組質粒混合物或FMDV疫苗株、ORFV和GTPV陽性組織樣品混合物的3次試驗,均能擴增出與預期大小相符的目的條帶。結果表明,該法具有較好的重復性。

注:M.DL 2 000 DNA 相對分子質量標準; 1～3.pFMDV、pORFV、pGTPV混合物(1∶1∶1);4～6.FMDV疫苗株、ORFV和GTPV混合核酸提取物;7.陰性對照。Note:M.DL 2 000 DNA Marker;1-3.Mixtures of pFMDV,pORFV and pGTPV(1∶1∶1);4-6.FMDV vaccine strain and nucleic acid mixtures of ORFV and GTPV;7.Negative control.圖5 多重PCR重復性試驗Fig.5 Reproducibility of multiplex PCR

2.5 臨床樣品檢測應用常規PCR和建立的多重PCR方法對132份全血樣品、7份全血模擬樣品和8份陽性羊口瘡痂皮組織進行檢測,結果顯示,多重PCR方法檢出全血樣品ORFV 感染病例1例,檢出模擬樣品FMDV 3份、ORFV5份、GTPV3份以及FMDV、ORFV 和GTPV的混合全血模擬樣品2份,檢出組織樣品ORFV 感染8份。與常規PCR檢查結果符合率為100%(表2)。

表2 臨床樣品的檢測結果Table 2 Test results of clinical samples

3 討論

多重 PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)是指通過一次反應可同時擴增出2個或以上的靶基因,因其低成本、高效率、高通量而被廣泛應用。該技術目前在疾病診斷和科學研究等領域應用較多。

多重PCR相較于常規PCR有諸多優勢,同時也存在著一些不足。該研究在對多重PCR敏感性檢測時發現,對FMDV和GTPV的最低檢測限達到103數量級的拷貝,而對ORFV需要104,通過總結前人建立的多重PCR方法發現,僅有少數建立的多重PCR檢測限能達到102數量級拷貝[8-9]。該研究在檢測臨床樣品時,全血樣品僅檢出1例ORFV感染,檢出率較低,但不能排除血液樣本病毒載量低,致使核酸模板未達到該多重PCR方法的最低檢測限的可能。而使用該方法檢測羊口瘡陽性病料,檢出率為100%。上述結果提示,使用該研究建立的多重PCR檢測ORFV、ORFV和GTPV時,病料的采集應盡可能取病毒載量較高的痂皮、水皰皮、水皰液和丘疹。若病原體難以培養,RNA或DNA提取率較低,如支原體、衣原體等病原,則需利用敏感性更高,檢測限可至100數量級的科學工具[10-11]。勾倩倩等[12]建立了一種針對藍舌病病毒、小反芻獸疫病毒、ORFV和GTPV的基于TaqMan探針技術的多重熒光定量PCR方法,在檢測病原時具有較好的特異性,并且對4種病原的最低檢出量分別達到17、12、8和9 拷貝/μL。隨著科學技術的不斷進步,基于熒光染料、熒光探針、微流控和于固相載體的多重熒光定量PCR技術將成為未來核酸多重檢測的重要研究方向,在疾病檢測方面扮演著重要角色[13-17]。

秦敏等[18]曾建立了藍舌病、FMDV、小反芻獸疫和水泡性口炎的多重PCR檢測方法,何亞鵬等[19]建立了涉及FMDV、藍舌病、小反芻獸疫的多重RT-PCR方法,在臨床應用上都有著較好的效果。因羊痘在西北地區較為流行,何亞鵬等[20]建立了針對綿羊痘病毒、GTPV及ORFV的多重PCR檢測方法。盡管前人有關多重PCR的研究均涉及FMDV、ORFV和GTPV,但尚缺乏針對FMDV、ORFV以及GTPV病原進行系統多重PCR檢測方法研究的相關報道。而該研究通過多項試驗驗證,建立了一種可同時檢測FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,為這3種病毒的快速診斷和流行病學調查等研究提供技術支持。

4 結論

該研究建立了可同時檢測FMDV、ORFV和GTPV的多重PCR方法,該方法具有較高的敏感性和特異性,可用于羊病的流行病學調查、鑒別診斷和疫情防控。