蕭氏松莖象病原真菌的調查與鑒定

吳躍開,劉童童,李繼業

(1.貴州省林業科學研究院,貴州貴陽 550005;2.貴州省農業科學院,貴州貴陽 550025)

蕭氏松莖象(HylobitelusxiaoiZhang)屬鞘翅目(Coleptera)象甲科(Curculionidae)松莖象屬(Hylobitelus),能夠危害濕地松、火炬松、馬尾松、華山松、黑松等松屬植物,在江西、湖南、湖北、廣西、廣東、貴州和福建等省(區)均普遍發生,已造成樹木死亡,被確定為我國林業危險性有害生物種類之一[1]。目前,生產實踐中大多采取營林措施、人工捕捉、引誘器誘殺、化學防治等方法對該害蟲進行防治,但由于蕭氏松莖象具有不同于其他森林害蟲的危害特點及生活習性,如幼蟲蛀食干基韌皮部并排出大量松脂,成蟲活動隱蔽、不善飛翔等,這些常規防治方法均具有明顯的局限性,存在操作及推廣難度大 、效率低、成本高和污染環境等問題,導致蕭氏松莖象的危害持續發生并不斷擴散蔓延,情勢愈來愈嚴重。尋找一條經濟、安全、持續有效的途徑來控制蕭氏松莖象的發生危害已成為當前林業生產上亟待解決的重大問題。

研究表明,昆蟲病原真菌是自然界控制害蟲群體的主要因素。在自然界,由真菌致死的昆蟲約占全部病原微生物致病死亡的60%。多年的研究和生產應用實踐表明,昆蟲病原真菌具有很多優點:多數種類?；圆粡?寄主范圍較廣,能防治多種害蟲;不需要非得從消化道侵入蟲體,體壁、氣孔均可入侵,增加感染害蟲的機會;真菌孢子具有較強的抗逆性,有的可在環境中存活幾年,有的在缺乏寄主時可營腐生生活,有利于種群的建立和延續;容易人工培養,可進行大量生產乃至工廠化生產;對人及天敵無害,不污染環境;在自然環境可不斷增殖,能長期控制蟲害且不易使其產生抗性[2-3]。研究表明,蕭氏松莖象的發生與森林環境中的光照、溫度、濕度等關系密切,具體而言,其喜歡光照、氣溫均相對較低,空氣及土壤溫度相對較高的林分環境[4-5],這與許多重要昆蟲病原真菌如白僵菌和綠僵菌對溫濕度及光照的要求非常接近,為昆蟲病原真菌的應用提供了極為有利的前提條件。

基于上述優點,昆蟲病原真菌的開發利用已成為解決蕭氏松莖象科學防控這一問題的重要途徑。鑒于此,筆者通過開展野外調查,結合人工誘集措施,收集蕭氏松莖象感病蟲體并進行病原菌的分離與鑒定,并對所分離到的菌種或菌株進行初步的致病性測試,以期為蕭氏松莖象的生物防治提供物質基礎及科學依據。

1 材料與方法

1.1 病原真菌的調查采集

1.1.1自然采集。調查地點選擇在貴州省貴陽市和安順市等地區,在蕭氏松莖象發生危害的典型林分進行常年野外調查,采集野外自然感病僵死的害蟲個體,帶回室內進行鏡檢及分離培養。分離時,如蟲體上生長明顯的菌絲層,則挑取菌絲進行分離;若體表菌絲層不明顯,則保濕恒溫培養(28 ℃、80%～100%)直至菌絲長出,再挑取菌絲進行培養純化,或對蟲體表面進行消毒后進行組織分離培養。培養基均選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

1.1.2土壤誘集。病菌誘集所用的土壤重點考慮采自森林環境,這是由于森林生態系統相對復雜,林地土壤所受的外界干擾作用也較小,土壤中的微生物多樣性較高、保存較好。從不同林分采集不同的森林腐殖層土壤樣品,分別置于廣口玻璃瓶中,然后將新鮮健康的蕭氏松莖象幼蟲和成蟲各10頭分別半埋于土壤樣品中;用紗網綁緊瓶口后將玻璃瓶置于恒溫恒濕培養箱中進行培養,培養條件為溫度28 ℃、 80%～100%RH,誘集過程中要給誘源昆蟲提供必要的食物(華山松小段嫩枝),保證其在感病之前具有正?；盍?同時要特別注意控制好溫、濕、光、氧氣等條件,保證誘源蟲體不出現異常死亡。定期觀測,以蟲體表面生長有肉眼可見的白色菌絲為感病標準。挑取菌絲進行分離純化培養,培養基均選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。

1.2 病原真菌的分類鑒定

1.2.1形態鑒定。將各病原真菌菌株的純培養物置于光學顯微鏡下觀測其顯微形態特征,包括菌落的形態、質地、顏色等,以及分生孢子梗、分生孢子大小和形狀及其著生方式等。 參考相關文獻[6-11],對各菌株進行初步鑒定。

1.2.2分子鑒定。采用真菌DNA提取試劑盒對各病菌的總DNA進行提取,并以通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增,得到的PCR產物經純化切膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,測得的序列在NCBI上進行同源性比對。

1.3 病原真菌的生物測定對采集到的代表菌株進行生物測定。首先,用0.1 %吐溫-80的無菌水將不同菌株配制成濃度相接近的孢子懸浮液(不同菌株的濃度控制在8.5×106～1.2×107個/mL)。其次,準備足夠數量的新鮮健康的蕭氏松莖象幼蟲和成蟲。每一種菌液分別對幼蟲和成蟲進行致病性測試;每1種菌液作1個處理,每處理3個重復,每重復中幼蟲、成蟲各10頭。

在消毒的培養皿底部放置雙層濾紙,將測試蟲放置濾紙上,然后用配制好的菌液均勻噴霧至害蟲體上,使害蟲全體及濾紙均完全濕潤(避免培養皿底部有過多積水以免將測試蟲淹死)。以噴無菌水作為對照。蓋上皿蓋后將培養皿置于恒溫恒濕培養箱中培養,培養條件為28 ℃、 80%～100% RH,當發現濾紙干燥時滴加無菌水以維持皿內濕度。分別于第5天、第10天、第15天檢測蟲體感病狀況,統計感病率。由于病菌入侵定殖前期階段無明顯外在表現,不易判斷,以害蟲體表生長出比較明顯的白色菌絲為其感病的唯一判斷標準。

2 結果與分析

2.1 采集菌種情況2019—2020年共采集到蕭氏松莖象病原真菌的有效菌種(菌株)12個,其中自然感染菌株7個(寄主均為成蟲),土壤誘導感染菌株5個(寄主均為幼蟲)(表1)。

表1 蕭氏松莖象病原真菌調查采集結果Table 1 Investigation and collection results of pathogenic fungi of Hylobitelus xiaoi Zhang

調查結果表明,自然條件下蕭氏松莖象成蟲感染病原真菌的現象比較普遍;相比之下蕭氏松莖象幼蟲在自然條件下一般不感染真菌病害,究其原因,可能是由于幼蟲階段為蛀食性,且其蛀道內塞滿大量脂質物,隱蔽性極強,外界病原物難以接觸并完成侵染過程。

森林腐殖層土壤中也含有大量的蕭氏松莖象病原真菌。竹林下腐殖土誘導感染率60%,闊葉混交林下腐殖土誘導感染率100%,馬尾松林下腐殖土誘導感染率90%,華山松林下腐殖土誘導感染率90%。人工土壤誘集處理中,僅發現幼蟲感病而成蟲均不見感染,究其原因,因幼蟲體壁相對較薄,被病原真菌入侵感染的概率比成蟲大得多。

2.2 病原菌的鑒定通過對各菌株形態特征的觀測,結合其rDNA ITS序列的測定與比對結果,得到各菌株的分類鑒定結果(表2)。鑒定結果表明,自然條件下,擬球孢白僵菌(Beauveriapseudobassiana)是蕭氏松莖象最常見的病原菌種類,采集頻率為57.1%,球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、綠僵菌(Metarhiziumsp.)及Lecanicilliumsp.采集頻率均為14.3%。而在土壤人工誘集方法中,共獲得5個菌株,其中綠僵菌菌株4個(占80%)、白僵菌菌株1個(占20%),說明土壤中所含的主要病原真菌種類多為綠僵菌屬。

2.3 病原菌的生物測定生物測定結果表明,不同菌種(菌株)對蕭氏松莖象成蟲、幼蟲的致病速度及致病率存在較大差異(表3)。

表3 不同菌株對蕭氏松莖象幼蟲及成蟲的室內致病性測試結果Table 3 Indoor pathogenicity test results of different strains on the larvae and adults of Hylobitelus xiaoi Zhang

從表3可以看出,人工接種后,幼蟲在第5天即可發現被感染者,而成蟲在第5天尚未發現感染者,但第10天檢測時已發現大量感染者。以幼蟲第5天感病率或成蟲第10天感病率為致病速度指標,以第15天感病率為最終致病率指標,結果見表4。從表4可以看出,擬球孢白僵菌Beauveriapseudobassiana的5個菌株(ZR100、ZR168、ZR345、ZR349、YJ005)和球孢白僵菌Beauveriabassiana的1個菌株(ZR225)對蕭氏松莖象成蟲及幼蟲均表現出明顯的致病性;其中ZR100菌株的致病性最強,其致病速度及最終致病率均最高。幾個綠僵菌菌株Metarhiziumsp.(ZR208、 YJ001、YJ002、YJ003、YJ004)對幼蟲均有明顯的感染效果(第15天感染率達53.3%～70.0%),但對成蟲的感染效果不明顯。輪枝菌菌株Lecanicilliumsp.(ZR093)對幼蟲的感染率最差(第15天感染率僅為26.6%),且不易感染成蟲。

表4 不同菌株對蕭氏松莖象幼蟲及成蟲的致病速度及致病率Table 4 Infection speed and infection rate of different strains on the larvae and adults of Hylobitelus xiaoi Zhang 單位:%

根據分類鑒定結果,結合菌種來源、形態特征、致病性等,將調查到的12個蕭氏松莖象病原真菌菌株劃分為以下5類(表5,圖1～5)。

表5 蕭氏松莖象病原真菌菌株的分類Table 5 Classification of entomopathogenic fungal of Hylobitelus xiaoi Zhang

注:a.成蟲感病狀;b.病原菌的分生孢子梗及分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Conidiophores and conidia.圖1 病原菌株(ZR093)Lecanicillium sp.感染癥狀及顯微形態特征Fig.1 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Lecanicillium sp.(ZR093)

注:a.成蟲感病狀;b.培養菌落;c.分生孢子梗;d.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Cultivated colonies;c.Conidiophores;d.Conidia.圖2 病原菌株(ZR100)Beauveria pseudobassiana感染癥狀及顯微形態特征Fig.2 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Beauveria pseudopassiana (ZR100)

3 結論與討論

自然環境條件下廣泛存在蕭氏松莖象的致病病原真菌,包括白僵菌屬(Beauveria)、綠僵菌屬(Metarhizium)以及輪枝菌屬(Lecanicillium)等屬的真菌。其中白僵菌屬的擬球孢白僵菌Beauveriapseudobassiana和球孢白僵菌Beauveriabassiana對蕭氏松莖象的成蟲和幼蟲均具有較高的感染力,是蕭氏松莖象的2個主要自然寄生真菌種類。相比之下,綠僵菌(Metarhiziumsp.)雖然對幼蟲具有較高的感染率,但成蟲感染性較弱(該試驗未見感染);表現最差的是輪枝菌(Lecanicilliumsp.),其不但在自然條件下較少發現感染者,室內試驗對幼蟲的感染率較差,對成蟲更無感染。

該研究中發現的擬球孢白僵菌(Beauveriapseudobassiana)作為蕭氏松莖象的重要病原菌系首次報道。該菌除具有明顯較高的致病性,也是該調查中發現頻率最高的種類,而且在森林土壤中均有存在,說明這個種類是蕭氏松莖象的優勢生防菌。擬球孢白僵菌自身也存在特異性分化的菌株,不同菌株的生長特性及其對害蟲的致病性可能差異較大,如該研究中的擬球孢白僵菌菌株ZR100,不但有其特殊的菌落特征(菌落淡黃,后期呈醒目的鵝黃色放射狀),而且在室內感染試驗中還具有比另外幾個菌株更高的致病速度及最終致病率(即具有最強的致病性),應成為蕭氏松莖象生防菌劑的首選菌種。

注:a.成蟲感病狀;b.大量的疏松分生孢子頭;c.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.A large number of loose conidia balls;c.Conidia.圖4 病原菌株(ZR225)Beauveria bassiana感染癥狀及顯微形態特征Fig.4 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Beauveria bassiana(ZR225)

注:a.成蟲感病狀;b.幼蟲感病狀;c.培養菌落;d.分生孢子。Note:a.Symptoms of adult infestation;b.Larval infestation;c.Cultured colonies;d.Conidia.圖5 病原菌株(ZR208,YJ001,YJ02,YJ003,YJ004)Metarhizium sp.感染癥狀及顯微形態特征Fig.5 Infection symptoms and microscopic morphological characteristics of Metarhizium sp.(ZR208,YJ001,YJ02,YJ003,YJ004)

要真正實現該生防菌株的開發及推廣應用,還需要解決以下一些關鍵技術問題:①開展該菌株的生物學特研究,掌握其營養生長及產孢的最佳溫、濕、光、營養等條件;②研究并掌握大規模生產所需的最佳營養配方及生產工藝優化條件等;③研制具有自主知識產權的真菌病原制劑及其適當劑型;④為提高生防菌在林間的長期高毒力及穩定性,可考慮開展微菌核菌劑生產研究,甚至可以利用新型基因編輯技術人為創造出長期高效穩定的轉基因菌株;⑤需要針對蕭氏松莖象的生物學特性,結合各種林分特點,通過試驗制定針對性強的林間菌劑施放技術規程。