鐵皮石斛種子組培繁育技術

董 薇,余永亮,楊紅旗,許蘭杰,譚政委,楊 青,李 磊,安素妨,魯丹丹,梁慧珍

(河南省農業科學院芝麻研究中心,河南鄭州 450002)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale),又名黑節草,為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物,鐵皮石斛是珍貴的中草藥,具有極高的保健功效,性甘,微寒,歸胃、腎經,益胃生津,滋陰清熱[1]。鐵皮石斛是我國珍貴的國家級二級保護植物,對生長環境要求苛刻,自然繁殖率很低,常規分株扦插等繁殖方式效率低,耗時長,不能滿足生產需要,因此大多采用組織培養方式繁殖鐵皮石斛種苗以滿足生產需求[2-6]。該研究以河南鐵皮石斛的種子為外植體,以馬鈴薯泥為培養基添加物,對種子組培實生苗的培養過程加以優化,為河南鐵皮石斛種質資源開發及工廠化育苗提供理論和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料鐵皮石斛種子采摘自河南省農業科學院玻璃溫室,人工授粉后選擇八成熟的蒴果。

1.2 培養條件該試驗采用1/2MS、MS為基本培養基,附加不同濃度6-BA、NAA、馬鈴薯泥,培養基中蔗糖為30 g/L,瓊脂為6 g/L,pH為5.8～6.0。培養條件為溫度(25±2)℃,光照2 000 lx,時間16 h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1材料消毒。將鐵皮石斛蒴果先用毛刷在流水下洗凈,在超凈工作臺上,先用75%乙醇浸泡30 s,再用84消毒液浸泡10 min,用無菌水沖洗3～4次后置于無菌濾紙上晾干水分。

1.3.2種子萌發。用剪刀剪開一端,將種子倒在滅菌水里,每瓶用移液槍吸取1 mL均勻撒在誘導培養基上。以1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥作為基礎培養基,添加不同濃度的NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L),分析不同濃度激素組合對鐵皮石斛種子萌發的影響。每個處理10瓶,重復3次。暗培養3 d促進種子萌發,隨后光照培養。

1.3.3原球莖增殖分化。將種子萌發獲得的原球莖接種在繼代培養基上。有機添加劑可以減少新生組織褐化并促進原球莖增殖,繼代培養基以MS為基礎培養基。添加不同濃度激素組合6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)、NAA(0.3、0.5、1.0 mg/L)和有機物(20、40、60、80 g/L馬鈴薯泥),觀察每種培養基中原球莖增殖情況。每處理20瓶,每瓶接種5個原球莖,3次重復,培養45 d后統計增殖情況,培養90 d后統計原球莖分化生長情況。

1.3.4生根壯苗。選取繼代增殖中3 cm左右、長勢一致的幼苗,轉接至生根培養基中,以MS+1.0 g/L活性炭為基礎培養基,添加不同濃度NAA和馬鈴薯泥,每種培養基接種20瓶,每瓶接5株,3次重復,培養90 d。

1.3.5煉苗移栽。當生根苗長至3～5 cm且有3～4片葉時,即可煉苗移栽。將培養瓶置于溫室煉苗7 d,取出試管苗,用清水洗凈幼苗根部培養基,置于通風陰涼處1 h晾干水分。將煉苗后的試管苗移栽到松樹皮基質中并澆透水,之后基質保持一定濕度即可。鐵皮石斛喜濕、耐寒,移栽環境需陰涼,避免陽光直射,空氣相對濕度不低于80%。

2 結果與分析

2.1 不同濃度激素對鐵皮石斛種子萌發的影響培養10 d后,陸續可見鐵皮石斛種子萌發,種胚黃綠色并逐漸增大,培養28 d后,大部分種胚顏色轉綠并進一步膨大,可見圓錐狀葉原基。統計結果(表1)表明,4種培養基都能使鐵皮石斛種子萌發,并生長成圓錐狀原球莖。比較幾種培養基的萌發時間和長勢可知,只添加馬鈴薯泥萌發時間長,且原球莖生長較慢,個體偏小,且原球莖誘導出現少量黃綠色。培養基中添加NAA質量濃度為0.1 mg/L時,鐵皮石斛種子萌發時間明顯縮短,原球莖綠色,隨著培養基中添加NAA質量濃度增加,鐵皮石斛種子萌發時間變短,且原球莖生長變快,顏色變綠,但當NAA添加質量濃度為0.3 mg/L時,隨著培養時間的延長,原球莖部分出現半透明狀。因此,1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于鐵皮石斛種子萌發,該培養基中鐵皮石斛種子萌發快,顏色深綠,長勢旺盛。

2.2 不同濃度激素對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響從表2可以看出,在MS培養基中添加不同濃度的6-BA和NAA均能促進鐵皮石斛原球莖增殖和分化。6-BA濃度在1.0～2.0 mg/L,鐵皮石斛原球莖增殖和分化系數整體呈上升趨勢,培養基添加不同濃度6-BA和NAA組合,鐵皮石斛原球莖增殖生長和分化生長有一定區別,6-BA在同一濃度水平時,隨著NAA濃度的升高原球莖增殖率增加而分化系數先增加后減少,而且,當6-BA和NAA添加量分別達到2.0和1.0 mg/L時,培養90 d出現部分玻璃化。MS添加2.0 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA更適合原球莖增殖、分化,原球莖增殖過程中顏色深綠,新生原球莖飽滿,分化成苗后苗色濃綠,生長旺盛。

表2 不同濃度激素對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響Table 2 Effects of different concentrations of hormones on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.3 添加馬鈴薯泥對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響從表3可以看出,培養基中添加馬鈴薯泥,鐵皮石斛原球莖增殖和分化速度沒有明顯變化,但是隨著馬鈴薯泥添加量的增加,添加馬鈴薯泥培養基中原球莖更加膨大,顏色更深,在培養90 d后,分化的幼苗高度略有降低,但幼苗莖粗增加、葉片更大。馬鈴薯泥在原球莖增殖階段能夠明顯增加增殖系數,在分化階段,雖然添加馬鈴薯泥后分化系數增加,但是增加系數低于增殖過程中的系數。添加量在80 g/L時,由于馬鈴薯本身所含淀粉,培養基質地較硬,因此最終選擇馬鈴薯泥添加量為60 g/L。

2.4 鐵皮石斛組培苗生根培養從表4可以看出,鐵皮石斛幼苗生根馬鈴薯泥添加量的增加根長先增加后減少,隨著NAA濃度增加根數明顯增多,結合表4中2種添加物對鐵皮石斛壯苗生根的綜合影響,1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L馬鈴薯泥幼苗長勢最好。

表3 添加馬鈴薯泥對鐵皮石斛原球莖增殖和分化的影響Table 3 Effect of adding mashed potato on the proliferation and differentiation of Dendrobium officinale protocorms

2.5 鐵皮石斛馴化移栽煉苗7 d后,鐵皮石斛葉色轉深,莖稈明顯粗壯,根系生長,即可移栽。移栽時選擇直徑1.0～1.5 cm的松樹皮基質,可在表面覆蓋苔蘚以保濕,移栽后大棚濕度在85%左右直至新葉長出,成活率達到90%以上。

表4 添加物對鐵皮石斛壯苗生根的影響Table 4 Effects of additives on the rooting of Dendrobium officinale seedlings

3 討論與小結

石斛屬植物組織培養中常利用的外源激素主要是BA、ZT和KT等細胞分裂素類和NAA、IAA、IBA等生長素類[7],楊立昌等[8]研究表明6-BA濃度在3.0 mg/L時原球莖誘導效果最好,而張雪梅等[9]研究表明6-BA濃度超過1.0 mg/L原球莖生長受到抑制。張華通等[10]研究表明6-BA與NAA對石斛種子的誘導效果不同,6-BA更有利于原球莖的增殖,而NAA對芽苗的生長更有益。現在石斛屬植物組織培養過程中有機添加物主要是蘋果、香蕉、椰汁、馬鈴薯、蛋白胨等。俞涵曦等[11]研究表明幾種有機添加物中40 g/L馬鈴薯對串珠石斛原球莖增殖分化的促進效果最好。

該試驗以鐵皮石斛種子為材料,以馬鈴薯泥為有機添加物,研究了鐵皮石斛種子萌發到原球莖增殖和分化,再到組培苗壯苗生根和煉苗移栽過程中不同培養基激素添加配比的影響。研究結果表明,1/2MS+10 g/L馬鈴薯泥+0.2 mg/L NAA更有益于鐵皮石斛種子萌發,MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 g/L馬鈴薯泥適合鐵皮石斛原球莖增殖和分化,原球莖深綠,長勢旺盛,分化出的幼苗莖葉深綠,粗壯旺盛。壯苗生根階段最終選擇1/2MS+1.0 g/L活性炭+0.5 mg/L NAA+40 g/L馬鈴薯泥,鐵皮石斛幼苗生長健壯,移栽易成活。