氧化苦參堿對TGF-β1誘導肺成纖維細胞MRC-5的增殖和分化的作用*

肖一佳,趙素娥,周若蘭

(南華大學附屬長沙中心醫院 呼吸與危重癥醫學科,湖南 長沙 410001)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是多種原因所致的肺功能進行性、不可逆性下降,是多種急性和慢性肺損傷最常見的臨床結果,其主要病理特征包括肺泡結構破壞、肺成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積,從而導致肺順應性降低和氣體交換障礙,最終導致廣泛的瘢痕形成、肺功能喪失,甚至死亡[1]。PF不是單一病因引起的疾病,而是由多種原因引起,如自身免疫/結締組織疾病(如類風濕關節炎或硬皮病)、藥物相關(如抗心律失常胺碘酮或化療藥物博來霉素)、職業暴露(如長期粉塵接觸、放射線接觸)或一些過敏原接觸等,臨床上有一部分PF患者因找不到確切病因,稱之為特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)。IPF主要發生在50歲以上的人群中,診斷時2/3的患者年齡超過60歲,男性多于女性[2]。在美國和歐洲,IPF的患病率估計為10～20/10萬人,而診斷后的中位生存期只有3～5年[3-4]。目前臨床上治療PF藥物主要為吡非尼酮和尼達尼布,但它們不能阻止或逆轉疾病進展或降低死亡率,只是小幅降低肺功能惡化的發生率[5-6];且由于脫靶效應導致惡心、疲勞和腹瀉等癥狀,患者通常也難以耐受這些藥物,因此臨床迫切需要深入研究PF的發病機制,尋找更有效的治療策略。豆科槐屬植物苦參是我國的傳統中草藥,氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從苦參中提取分離出的一種活性生物堿成分。累積證據表明OMT具有多種生物學和藥理學特性,例如抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、抗纖維化、抗氧化等[7-9]。Xu等[10]證明OMT能夠減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化,這種有益作用與抑制博來霉素誘導的肺部炎癥和脂質過氧化以及減少成纖維細胞增殖和膠原合成有關。盡管如此,OMT在肺纖維化過程中發揮抗纖維化作用的確切機制尚未完全闡明。Notch信號通路是一個高度保守的信號轉導通路,廣泛表達于哺乳動物組織中,參與哺乳動物胚胎細胞和成體細胞的增殖、分化、凋亡和細胞周期調控等多個細胞生理過程。研究發現Notch信號可直接導致肺纖維化,可能還與其下游因子Hes1過表達導致α-SMA及Ⅰ型膠原表達增加相關[11]。還有文獻報道,TGF-β1是Notch信號通路激活的關鍵細胞因子,可通過Smad3上調Notch受體相應配體Jagged1和Notch信號靶基因Hey1的表達,兩者共同作用于Notch信號通路的靶基因,誘導上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)發生[12]。目前關于OMT是否可調控Notch信號抑制PF發生發展的研究較少,本研究以人胚肺成纖維細胞(MRC-5)為PF細胞模型,以Notch信號為靶點深入研究OMT抑制PF作用機制,探討OMT防治PF的作用及機制,為PF肺纖維化的防治發掘新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OMT(純度,98%)購自上海綠谷制藥有限公司,MRC-5細胞購自北京鼎國長生生物技術有限公司,重組人TGF-β1購自美國PeproTech公司,Notch信號通路抑制劑DAPT (N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁基酯)購自美國BioGems;Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)來自美國GIBCO公司,ELISA試劑盒來自上海迪澤生物工程公司。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組與造模 MRC-5細胞分為空白對照(Control)組、TGF-β1組(TGF-β1 20 μg/L作用24 h)、OMT低劑量(OMT-L)組(0.05 g/L)、OMT高劑量(OMT-H)組(0.1 g/L)和DAPT組(1 μmol/L),其中OMT高、低劑量組及DAPT組實驗時與TGF-β1同時加藥處理24 h。

1.2.2CCK8細胞增殖實驗 將MRC-5細胞根據一定細胞密度均勻鋪于96孔板,根據實驗分組加入不同藥物處理24 h,再進行細胞吸光度檢測。

1.2.3細胞免疫熒光實驗 處理后的MRC-5細胞用4%多聚甲醛固定15 min,0.5%Triton-X 100通透20 min,室溫下用10%牛血清白蛋白封閉1.5 h,4 ℃與兔抗α-SMA單克隆抗體(1∶50稀釋度)孵育過夜,次日回收一抗、并在室溫下與二抗(fitc標記的羊抗小鼠IgG,1∶50稀釋)孵育1 h,再予以4-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,5 g/L)孵育10 min,最后使用熒光顯微鏡(尼康公司,東京,日本)檢測熒光吸光度。

1.2.4蘇木精-伊紅染色 按實驗分組要求分組加藥處理,取6孔板上的MRC-5細胞,用4%多聚甲醛固定15 min,蘇木精染10 min,多余染料用自來水洗滌,伊紅染色2 min,光鏡下觀察細胞形態學變化。

1.2.5酶聯免疫吸附實驗(Elisa) 按試劑盒要求操作步驟,標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL;分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL,然后再加待測樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。加酶:每孔加入酶標試劑100 μL,空白孔除外。溫育:使用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌:揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗。

1.2.6聚合酶聯反應(PCR) RNA提取:從-80 ℃冰箱中取出待測細胞樣本,加入Trigol液1 mL、劇烈震蕩混勻,室溫放置5 min,使其充分裂解,4 500 r/min離心5 min,吸上清轉入無RNase的1.5 mL EP管中;向EP管中加入200 μL氯仿,漩渦震蕩儀震蕩混勻15 s(無分層現象),4 ℃靜置5 min,4 ℃ 4 500 r/min離心15 min,吸取上清液(約600 μL),轉移至新的無RNase的1.5 mL EP管中;再按等體積加入異丙醇,上下顛倒充分混勻,靜置30 min,4 ℃ 4 500 r/min 離心10 min,棄上清,RNA沉于管底,加入1 mL 75%乙醇(無RNase水配置),懸浮沉淀,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min,棄上清。室溫晾干或真空干燥5～10 min,最后將獲得的總RNA溶于30 μL無RNase水中。反轉錄體系:總RNA 2.5 μL、10×Buffer 4 μL、dNTPs(10 mmoL) 1 μL、Oligo(dT)18(50 μmoL) 1 μL、引物(100 μmoL)0.5 μL、MMLV逆轉錄酶(200 U/μL)1 μL、DEPC H2O 10.5 μL,總體系20 μL。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MRC-5細胞增殖

CCK-8實驗顯示,與Control組相比,TGF-β1組顯著增加MRC-5細胞的增殖,DAPT和OMT組抑制了TGF-β1對MRC-5細胞的增殖作用,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與Control組比較,P<0.01;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

2.2 MRC-5中的α-SMA表達

α-SMA是上皮間充質轉化特異標志物,是細胞模型造模成功的關鍵。細胞免疫熒光染色顯示,與Control組比較,TGF-β1組α-SMA明顯增高,而OMT-L、OMT-H組及DAPT組可減少α-SMA表達。蘇木精伊紅染色結果顯示,與TGF-β1組比較,OMT及DAPT組減少TGF-β1誘導MRC-5的細胞增殖。見圖2、圖3。

注：(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

圖3 各組MRC-5細胞(蘇木精伊紅,×20)

2.3 MRC-5中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達

Ⅰ型和Ⅲ型膠原是細胞外基質的主要成分,通過Elisa試劑盒檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的分泌。與Control組比較,TGF-β1組細胞裂解液和細胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的水平顯著增加,而OMT和DAPT組降低TGF-β1誘導的細胞裂解液和細胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A～B為細胞上清液及細胞沉淀Ⅰ型膠原表達含量,C～D為細胞上清液及細胞沉淀Ⅲ型型膠原表達含量;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

2.4 Smad2、Smad3、Notch3和Hey1的基因表達

Notch信號通路主要通過受體與配體結合及后續靶蛋白的激活來介導。PCR分析顯示,與Control組相比,TGF-β1組中Smad2、Smad3、Hey1和Notch3的基因表達水平顯著升高,OMT和DAPT組降低了TGF-β1誘導上述基因表達水平,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：A為Smad2 mRNA表達含量,B為Smad3 mRNA表達含量,C為Notch3 mRNA表達含量,D為Hey 1mRNA表達含量;(1)與Control組比較,P<0.05;(2)與TGF-β1組比較,P<0.05。

3 討論

PF是一種進行性慢性肺部疾病,其特征是ECM過度積累、膠原蛋白沉積異常,導致組織結構喪失并限制其氣體交換功能[13]。EMT是最重要的肺纖維化的病理過程,也是纖維化疾病發生、發展的起始和可逆步驟。TGF-β1是導致纖維化的關鍵調控因子,其介導的Smads信號通路在EMT過程中起重要作用[14]。在正式實驗之前,通過預實驗CCK8實驗發現,TGF-β1刺激MRC-5細胞呈濃度依賴及時間依賴促進細胞增殖,而DAPT以劑量依賴抑制細胞增殖,最后根據相關文獻以及本研究前期基礎,最后確定TGF-β1 20 μg/L作用24 h為肺纖維化細胞模型,并確定DAPT工作劑量為1 μmol/L。實驗發現,DAPT組和OMT組處理后可減弱TGF-β1誘導的細胞增殖。蘇木精-伊紅染色證實,OMT 和 DAPT 顯著降低TGF-β1誘導的MRC-5 細胞增殖,以上提示OMT及DAPT可以在體外抑制TGF-β1誘導MRC-5細胞增殖,然而確切機制不明。

Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原主要由ECM組成,PF最重要的病理特征是ECM的過量產生[15-16]。α-SMA是評價EMT的常用指標,也是肌成纖維細胞的特征,可通過ECM的過度分泌導致氣道重塑和纖維化[17-18]。通過細胞免疫熒光,TGF-β1促進MRC-5細胞分化和且α-SMA表達增加,而OMT和DAPT組降低了α-SMA的表達,提示OMT組及DAPT組可以抑制TGF-β1誘導MRC-5細胞EMT。另外通過Elisa檢測Ⅰ及Ⅲ型膠原表達,無論是在細胞上清液還是細胞裂解液中TGF-β1組可促進Ⅰ及Ⅲ型膠原表達,而OMT組和DAPT組均可減少膠原表達。但OMT是否通過抑制 Notch 信號傳導來促進膠原蛋白合成尚不清楚。據報道,Notch1的激活直接刺激α-SMA表達并誘導肌成纖維細胞分化,而Notch的缺失減少肺中的肌成纖維細胞轉化和膠原蛋白分泌,表明Notch1信號傳導在纖維化的發展中起重要作用,升高的Notch3水平導致 PDGFRb 1成纖維細胞增殖。因此,Notch 信號在肺泡形成過程中的上皮-間充質相互作用中也起著重要作用[19-20]。

Notch3是Notch信號關鍵受體[21-22],Hey1是Notch信號下游關鍵靶基因[23-24],TGF-β1促進MRC-5細胞中Notch信號通路相關基因Notch3、Hey1的表達,同時也促進TGF-β通路相關蛋白Smad2、Smad3的基因表達,這表明TGF-β1可激活Notch信號通路以誘導PF。然而DAPT組可以減少Smad3、Notch3、Hey1表達,這提示抑制Notch信號也可間接抑制TGF-β信號Smad3表達,這提示TGF-β信號與Notch信號之間可能存在交叉作用[25]。與TGF-β1處理相比,OMT組可減少上述相關基因的的表達,提示OMT可抑制TGF-β1誘導MRC-5細胞增殖并可能與介導Notch信號通路來防止纖維化。