miR-556-3p通過調控PTEN/AKT信號通路影響肝細胞癌的轉移活性*

仲金龍,施 琳

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發性肝癌類型,在癌癥導致的死亡原因中排名第三位[1,2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內源性、短的非編碼RNA分子,具有重要的基因調節因子的功能[3,4]。研究證據表明,miRNA的生物學功能與許多人類疾病有關,包括癌癥[5]。通常,人類癌癥miRNA位于基因組斷點區域,在腫瘤發生和發展過程中發揮腫瘤抑制基因或腫瘤促進基因的作用[6]。最近的研究表明,miRNA表達在多種癌癥中都有發現,包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和HCC等[7-9]。最近研究發現肝癌細胞的靜脈轉移與多種miRNA相關,miR-556-3p就是其中之一[10,11]。同時,與過表達miR-556-3p組相比,miR-556-3p低表達與腫瘤復發和患者較低的生存率密切相關。體外研究表明miR-556-3p能夠降低肝癌細胞生長[12,13]。因此,本研究通過探索miR-556-3p與HCC發生發展的關系,以期為HCC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織、細胞和試劑 2020年3月～2022年2月我院診治的HCC患者86例,獲得所有患者書面知情同意書后,經我院醫學倫理委員會批準開展研究。手術期間收集部分切除的HCC組織和癌旁肝組織,立即置于冷凍并保存在液氮中。肝癌細胞系HepG2 和正常肝細胞系LO2購自中國科學院細胞生物學研究所。RPMI-1640培養基(Gibco,Maryland,USA);Lipofectamine 2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);miR-556-3p mimic、miRNA NC、磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)siRNA和PTEN cDNA(美國Invitrogen公司);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司);抗PTEN、抗β-actin、抗磷酸化蛋白激酶B (protein kinase B,p-Akt)和抗AKT抗體(美國Abeam公司);CCK-8溶液(北京索萊寶);免疫組化試劑盒(杭州聯科生物)。

1.2 細胞轉染 細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基、37℃、5% CO2條件下培養。取對數生長期的細胞,接種6孔板,每孔1×106,孵育24 h。使用Lipofectamine 2000 ,根據試劑說明書轉染100 nM PTEN siRNA、miR-556-3p mimic或miRNA NC。當PTEN cDNA質粒和miR-556-3p模擬物共同轉染時,首先將miR-556-3p mimic (100 nM)轉染細胞。48 h后,用PTEN cDNA質粒(2 μg)和miR-556-3p mimic(100 nM)共轉染細胞72 h。

1.3 細胞RNA提取和miR-556-3p檢測 使用TRIzol試劑按照說明書提取總RNA。采用實時熒光定量PCR法檢測mRNA相對水平。miR-556-3p引物為:5-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3(sense),5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3(antisense);snRNA U6基因作為對照,引物為:5-ACCAGTGGCACTGTTGTTCACC-3(sense),5-TTCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3(antisense)。在美國Bio-Rad iQ5 Real-time PCR儀上使用Real-time PCR Mixture Reagent (BIO-RAD)進行PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對水平。

1.4 細胞蛋白表達檢測 采用Western Blotting法,收集細胞,并用PBS重懸,經2000 r/m離心5 min,在RIPA冷裂解液中裂解30 min。再12000 r/m離心10 min,收集上清液,用等量分光光度法測定蛋白濃度,經10% SDS-PAGE凝膠分離,轉移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶/TBST在室溫下封閉1 h。加入抗PTEN、抗β-actin、抗p-AKT和抗AKT一抗在4℃下孵育過夜。加入合適的酶標二抗室溫孵育1 h。加入HRP底物ECL,在凝膠系統成像。

1.5 細胞存活實驗分析 使用細胞計數試劑盒CCK-8檢測細胞存活情況。取細胞(1×105)在96孔微孔板中培養24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵育1 h,在450 nm處測定吸光度。

1.6 細胞侵襲實驗 使用Matrigel膠包被Transwell小室后,調整細胞數至5×104個/ml。取細胞懸液0.5 mL,加入Transwell小室內,在細胞培養箱中培養24 h。取出小室,將上室細胞擦凈,并用PBS洗滌,使用預冷的甲醇固定下室細胞30 min,采用結晶紫染色10 min,顯微鏡下取6個視野計算下室細胞數。

1.7 細胞凋亡分析 用miR-556-3p mimic、miR-556-3p NC、PTEN cDNA和PTEN siRNA轉染細胞。在轉染后48 h,用Alexa Fluor 488 annexin V/Dead Cell apoptosis Kit按照說明書進行凋亡檢測。細胞懸液(100 μl)與annexin V 5 μl和PI 1 μl在室溫下孵育15 min。使用BD LSR II流式細胞儀對染色細胞進行分析。

1.8 熒光素酶活性分析 通過Target scan工具網站得到miR-556-3p和PTEN的結合位點。將PTEN的3’-UTR片段插入熒光素酶終止密碼子下游的pGL3載體。使用快速定點誘變試劑盒生成突變型(mut-) PTEN。用螢火蟲熒光素酶的報告載體0.4 μg和海腎熒光素酶pRLTK對照載體0.08 μg,以及添加或不添加miR-556-3p mimic 0.5 μg,共轉染細胞。采用雙熒光素酶法連續測定螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

1.9 組織PTEN表達檢測 采用免疫組化法檢測,取癌組織和癌旁肝組織石蠟切片,脫蠟。使用檸檬酸鈉溶液修復抗原。用3%H2O2除去內源性過氧化物酶,用山羊血清封閉非特異性位點。加入抗PTEN單克隆抗體在4℃孵育過夜。次日,用PBS沖洗3次,用生物素標記的第二抗體孵育15 min,再加入DAB染色30 s。然后,用蘇木精復染1 min,乙醇梯度脫水、干燥后,用中性樹脂密封。

2 結果

2.1 細胞和組織miR-556-3p和PTEN水平變化 與LO2細胞比,HepG2 miR-556-3p水平顯著降低(圖1A);另外,經qRT-PCR和免疫組化檢測結果顯示,與癌旁組織比,miR-556-3p在HCC組織中表達下調,PTEN在HCC組織中表達上調(圖1B、圖1C)。這些結果提示miR-556-3p與PTEN可能在HCC發病機制中發揮重要作用。

2.2 不同方式轉染的HepG2細胞熒光素酶活性比較 應用TargetScan分析miR-556-3p的靶向基因,PTEN mRNA序列的3’-UTR包含兩個推測的miR-556-3p結合位點 (圖2A)。將miR-556-3p可能的結合位點分別克隆到pGL3載體中,驗證miR-556-3p在HepG2細胞靶向作用PTEN。與陰性對照比,miR-556-3p mimic和pGL3-wt 3’-UTR載體共轉染HepG2細胞熒光素酶活性顯著降低(圖2B)。

圖2 PTEN是miR-556-3p的直接作用靶點

2.3 過表達miR-556-3p和抑制PTEN對肝癌細胞增殖、侵襲和凋亡的作用情況 侵襲實驗結果發現,與miR NC組比,過表達miR-556-3p可顯著抑制HepG2細胞的侵襲能力(圖3A/B);在48 h、72 h和96 h,與miR NC組比,過表達miR-556-3p顯著抑制HepG2細胞增殖(圖3C);流式細胞術檢測結果發現,與miR NC組比,HepG2細胞過表達miR-556-3p顯著增加了細胞凋亡(圖3D)。

2.4 miR-556-3p通過靶向調控PTEN抑制AKT信號激活 蛋白免疫印跡檢測顯示,過表達miR-556-3p抑制AKT磷酸化和PTEN表達,這些效應被PTEN過表達所逆轉(圖4)。結果表明,miR-556-3p通過靶向作用PTEN,抑制AKT的激活。

圖4 miR-556-3p靶向調控PTEN/AKT信號通路

3 討論

在本研究中,我們發現與正常肝細胞系LO2相比,miR-556-3p水平在HepG2細胞顯著降低,在HCC癌組織中與匹配的非癌肝組織相比也顯著降低。我們的研究結果還表明,過表達miR-556-3p可顯著抑制肝癌細胞增殖、侵襲,并誘導細胞凋亡。這些結果提示miR-556-3p可能在HCC發生發展過程中起抑癌作用。因此,本研究結果提示,miR-556-3p是一種腫瘤抑制miRNA,通過靶向作用PTEN/AKT抑制肝癌細胞生長。

雖然我們發現miR-556-3p具有抑癌作用,但miR-556-3p在HepG2細胞的作用機制尚不清楚。為了探索miR-556-3p在HCC發生發展過程中的分子作用機制,我們應用生物信息學算法Target Scan分析靶基因,結果發現miR-556-3p可以靶向作用PTEN。PTEN是一個單次跨膜蛋白,由582個氨基酸組成[14]。PTEN過表達常見于黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和食管癌。PTEN能抑制癌細胞凋亡,增加癌細胞的侵襲和轉移能力[15]。許多信號通路都受PTEN調控,如NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、PI3K/AKT等[16]。之前的研究指出,在HCC患者,還發現PTEN表達升高。PTEN在HCC組織表達與腫瘤微血管浸潤、腫瘤分級和分期、復發率高相關[17,18]。在HCC組織或細胞,PTEN過表達通過增強PI3K/AKT、MAPK和Wnt/β-catenin信號通路等多種信號通路途徑,加快腫瘤細胞生長。

在我們的研究中,HepG2細胞過表達miR-556-3p可顯著下調PTEN蛋白表達。熒光素酶活性檢測表明,miR-556-3p可直接結合HepG2細胞PTEN。相關性分析顯示PTEN水平與HCC組織miR-556-3p呈反向相關。miR-556-3p可有效提高PTEN蛋白表達,與PTEN蛋白表達降低有關。這些結果表明,miR-556-3p可能通過調控PTEN表達而起到抑癌作用。我們的研究結果首次表明,miR-556-3p至少部分通過抑制PTEN在HCC組織細胞表達而發揮抑癌作用。