非酒精性脂肪性肝病患者腸道菌群及血清IL-17和INF-γ水平變化*

侯義林,曹風(fēng)華,紀(jì)小燕,蔡 燕

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver diseases,NAFLD)是指除酒精和其他明確損肝因素以外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征,包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)的肝硬化等疾病[1]。當(dāng)前,NAFLD已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因之一。普通人群NAFLD患病率在10%～30%之間[2]。臨床研究表明,NAFLD可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化和肝細(xì)胞癌,嚴(yán)重威脅患者生命健康[3]。NAFLD發(fā)病與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān),后者通過影響脂肪分解和胰島素分泌等導(dǎo)致脂代謝紊亂,進(jìn)而引起肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積[4]。此外,機(jī)體炎癥反應(yīng)能夠加重肝細(xì)胞損傷。白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)作為促炎因子能夠刺激免疫細(xì)胞釋放炎癥因子,加快脂質(zhì)沉積和異常氧化反應(yīng)[5]。γ-干擾素(gamma interferon,INF-γ)屬于Th1細(xì)胞因子,參與多種肝臟炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。近年來,肝臟疾病腸道微生態(tài)研究是眾多醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。肝臟疾病患者肝組織受損后可通過“腸-肝軸”引起腸道菌群的變化[7]。腸道微生態(tài)平衡是維持機(jī)體健康和阻止疾病進(jìn)展的重要條件[8]。NAFLD患者糞便腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和擬桿菌均發(fā)生異常變化[9],而這些變化可能與機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)[10]。本研究檢測(cè)了NAFLD患者腸道菌群及血清IL-17和INF-γ水平,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年1月～2022年1月我院收治的NAFLD患者102例,男62例,女40例;年齡為25～65歲,平均年齡為(46.5±9.4)歲。診斷符合2017年《亞太地區(qū)非酒精性脂肪性肝病指南簡(jiǎn)介》[11]的標(biāo)準(zhǔn)。NAFLD患者血清ALT水平大于正常值上限的2倍,持續(xù)時(shí)間大于4周者,診斷為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)自身免疫性肝病、病毒性肝炎等能導(dǎo)致脂肪肝的疾病;(2)胃腸道疾病;(3)心血管疾病;(4)腎功能障礙;(5)精神疾病;(6)血液系統(tǒng)疾病;(7)妊娠期或哺乳期女性;(8)惡性腫瘤;(9)近2周使用過微生態(tài)制劑和抗生素。另選擇同期來院的健康體檢者48例,男29例,女19例;年齡為24～66歲,平均年齡為(46.9±9.7)歲。兩組年齡和性別資料可比(P>0.05)。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

1.2 血清IL-17和INF-γ水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清IL-17和INF-γ水平(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.3 糞便菌群檢測(cè) 采集新鮮糞便1.5g,置于無菌管中,并于30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。取糞便0.1 g,加入生理鹽水9.9 mL稀釋,充分震蕩,制成稀釋液,稀釋梯度設(shè)置為1:102、1:103、1:104、1:105、1:106、1:107和1:108,選擇1:104、1:105和1:1063個(gè)稀釋梯度,分別吸取稀釋液1 mL,加于培養(yǎng)皿中,每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù),將稀釋液分別接種于培養(yǎng)雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌和腸球菌的選擇培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)雙歧桿菌和乳桿菌的培養(yǎng)皿置于厭氧罐中,37℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。將培養(yǎng)腸桿菌和腸球菌的培養(yǎng)皿直接置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h,在培養(yǎng)完成后,計(jì)數(shù)平板菌落數(shù),結(jié)果以每克新鮮糞便菌落形成單位的對(duì)數(shù)值表示,即lg CFU/g,lg CFU/g=菌落個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×(標(biāo)本質(zhì)量+稀釋量)/標(biāo)本質(zhì)量。計(jì)算B/E比值,即B/E比值=雙歧桿菌數(shù)量/腸桿菌數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD患者與健康體檢者腸道菌群比較 NAFLD患者乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量和B/E比值均顯著小于健康體檢者(P<0.05),而腸球菌和腸桿菌數(shù)量均顯著大于健康體檢者(P<0.05,表1)。

表1 兩組糞便腸道菌群比較

2.2 NAFLD患者與健康體檢者血清IL-17和INF-γ水平比較 NAFLD患者血清INF-γ水平顯著低于健康體檢者(P<0.05),而血清IL-17水平顯著高于健康體檢者(P<0.05,表2)。

表2 兩組血清IL-17和INF-γ水平比較

2.3 單純性脂肪肝與NASH患者糞便腸道菌群比較 在本組NAFLD患者中,發(fā)現(xiàn)NASH患者38例,單純性脂肪肝患者64例。NASH患者糞乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量和B/E比值均顯著小于單純性脂肪肝患者(P<0.05),而腸球菌和腸桿菌數(shù)量均顯著大于單純性脂肪肝患者(P<0.05,表3)。

表3 單純性脂肪肝與NASH患者糞便腸道菌群比較

2.4 單純性脂肪肝與NASH患者血清IL-17和INF-γ水平比較 NASH患者血清IL-17水平顯著高于單純性脂肪肝患者,而血清INF-γ水平顯著低于單純性脂肪肝患者(P<0.05,表4)。

表4 單純性脂肪肝與NASH患者血清IL-17和INF-γ水平比較

3 討論

NAFLD發(fā)病原因復(fù)雜,與遺傳、代謝、環(huán)境、應(yīng)激等多種因素有關(guān),其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[12,13]。有研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[14]。機(jī)體腸道菌群包括有害菌和有益菌,健康機(jī)體腸道中有害菌和有益菌保持動(dòng)態(tài)平衡,共同維持腸道微生態(tài)環(huán)境[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NAFLD患者腸道菌群紊亂后有害菌數(shù)量異常增加,有益菌數(shù)量明顯下降,進(jìn)而破壞腸道黏膜屏障,損害肝細(xì)胞,促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和壞死[16]。部分研究認(rèn)為,NAFLD患者腸道微生態(tài)失調(diào)能夠引起腸桿菌等革蘭氏陰性菌過度生長(zhǎng),細(xì)菌內(nèi)毒素可以通過受損的腸黏膜屏障進(jìn)入肝臟系統(tǒng),進(jìn)而刺激肝臟產(chǎn)生大量的炎癥因子,加重NASH[17]。

本研究結(jié)果顯示,NAFLD患者乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量、B/E比值、血清INF-γ水平均低于健康體檢者,而腸球菌、腸桿菌數(shù)量、血清IL-17水平均高于健康體檢者,說明NAFLD患者腸道菌群及血清IL-17和INF-γ水平均發(fā)生異常變化。腸道菌群種類繁多,數(shù)量龐大,多種菌群形成復(fù)雜的腸道微生態(tài)系統(tǒng),共同影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。乳桿菌、雙歧桿菌均為有益菌,而腸球菌和腸桿菌均為中性菌,但在特定條件下,腸球菌和腸桿菌可以轉(zhuǎn)為致病菌[19]。NAFLD患者肝臟病變使膽汁異常分泌,游離性膽汁酸對(duì)腸道內(nèi)酸堿平衡調(diào)節(jié)失控,進(jìn)而引起腸道菌群失調(diào)[20]。此外,肝臟病變后胃腸道蠕動(dòng)減弱,影響胃腸道分泌功能,腸道清除能力降低,使得有害菌過度繁殖[21]。本研究在NAFLD患者中發(fā)現(xiàn)NASH患者38例,單純性脂肪肝64例。NASH患者腸球菌、腸桿菌數(shù)量、血清IL-17水平均顯著高于單純性脂肪肝患者,而乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量、B/E比值、血清INF-γ水平均低于單純性脂肪肝患者。NAFLD患者肝功能受損導(dǎo)致腸道黏膜充血、水腫,腸道通透性增加,細(xì)菌及其內(nèi)毒素可以通過損傷的腸道黏膜屏障進(jìn)入肝臟系統(tǒng),加重機(jī)體炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致IL-17和INF-γ釋放改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),NASH小鼠腸道致病菌數(shù)量異常增加,有益菌數(shù)量明顯減少,導(dǎo)致腸道菌群紊亂,影響菌群結(jié)構(gòu)特征,導(dǎo)致細(xì)菌移位,引起腸道免疫屏障破壞,而腸道免疫系統(tǒng)應(yīng)答被激活后分泌炎性細(xì)胞因子,可加重NASH[22]。輔助性T細(xì)胞是連接腸道菌群和腸道免疫屏障的關(guān)鍵細(xì)胞亞群,Th1細(xì)胞可產(chǎn)生大量的INF-γ,Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-17。IL-17和INF-γ參與宿主感染、免疫、防御等病理學(xué)過程[23]。NAFLD患者腸道菌群失調(diào),與NASH密切相關(guān)。然而,影響腸道菌群的因素較多,飲食、基因、環(huán)境等多種復(fù)雜因素均可影響腸道菌群變化。深入研究NAFLD患者腸道菌群及血清IL-17和INF-γ水平變化意義重大。

綜上所述,NAFLD,尤其是NASH患者,腸道菌群及血清IL-17和INF-γ水平均發(fā)生異常變化。腸道菌群失調(diào)可能通過影響IL-17和INF-γ水平變化進(jìn)而影響疾病發(fā)生和發(fā)展。臨床上,可通過調(diào)整機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)及血清IL-17和INF-γ水平變化,以改善肝功能損傷。