上皮性卵巢癌患者血清外泌體miR-200c與組織NRP1表達、輔助化療反應及預后的關系

趙曉娟,魏珂,高雋,靳新星,董菲

(咸陽市第一人民醫院 婦科,陜西 咸陽 712000)

上皮性卵巢癌癥(epithelial ovarian cancer,EOC)占所有類型卵巢癌(ovarian cancer,OC)病例的90%,其特征是組織病理學、臨床和分子異質性[1-2]。EOC確切病因仍不清楚[3],不良結局與延遲診斷以及耐藥腫瘤細胞的持續存在有關[4-5]。對于晚期疾病,通常無法經手術治療[6]。為了改善這些患者的預后,迫切需要具有高靈敏度和特異度的無創快速診斷方法。微小RNA(microRNA,miRNA)是19～25個核苷酸的小非編碼RNA,可以通過與互補的靶mRNA雜交來調節基因表達,導致mRNA降解或直接抑制翻譯[7]。miRNA為人類基因表達提供了一種新的調控機制,并在多種生物過程中發揮重要作用[8]。尤其是存在于循環外泌體中的miRNA,其結構穩定,被認為是多種病理機制中有價值的生物標志物來源之一[8-9]。miR-200c是miR-200家族成員,其表達失調與OC的發生發展和耐藥性密切相關[10-11]。它可以通過促進上皮間質轉化、侵襲性、腫瘤生長和轉移來充當腫瘤促進劑[11]。另外,miR-200c過表達可改善不同類型癌癥(包括OC)對各種化療藥物的反應,并且其低表達與獲得性耐藥有關[10,12]。神經纖毛蛋白1(neuropilin1,NRP1)是一種跨膜糖蛋白,已被證明在腫瘤發生、癌癥侵襲和血管生成中發揮關鍵作用[13]。據報道,NRP1表達在OC組織中上調,并與OC分級分期、多藥耐藥性和預后不良有關[14-15]。最近,有研究指出miR-200c可通過靶向NRP1使耐藥的OC細胞敏感[10]。但血清外泌體miR-200c與NRP1的關系及其在預測OC患者化療反應和預后中的應用價值尚未見報道。本研究通過分析EOC患者血清外泌體miR-200c表達與組織NRP1表達、輔助化療反應及預后的相關性,以確定miR-200c作為腫瘤生物標志物的潛力。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年2月至2022年10月在我院診治的135例新診斷的EOC(112例漿液性、5例黏液性、12例子宮內膜樣、6例透明細胞癌)和30例良性腫瘤(20例漿液性和10例黏液性)患者。收集135例EOC患者的癌組織、48例癌旁正常卵巢組織(距癌組織>2 cm)以及30例良性腫瘤組織樣本,另收集所有參與者的血清(EDTA-K2抗凝劑)樣本,儲存在-20 ℃直至使用。兩組患者年齡相匹配,分別為31～88(64.53±12.19)歲和28～85歲(63.40±15.50)歲,具有可比性(P>0.05)。入選標準:病理學確診,所有患者均有手術卵巢組織可用;EOC患者接受初級減瘤手術和術后標準化療。排除標準:既往或伴發其他癌癥或分析用組織材料不足,未完成標準化療方案的EOC患者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,已獲得醫院醫學倫理委員會審核批準,所有受試者均出具書面知情同意書。通過電子病歷獲取EOC患者的臨床特征,包括年齡、體重指數(body mass index,BMI)、絕經狀態、國際婦產科學聯合會(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期、組織學分級、組織學分型、殘余腫瘤、化療周期。

1.2 EOC治療及效果評估

EOC患者根據FIGO分期系統[16]進行分期,并根據世界衛生組織(World Health Organization,WHO)分級系統進行分級。患者在術前3 d采集血清樣本,將術中新鮮的手術組織樣本保存在液氮中,隨后制作石蠟包埋(formalin-fixed and parrffin-embedded,FFPE)組織塊,連續切片后進行免疫組化分析。手術結果定義為完全細胞減滅(無肉眼可見腫瘤)、最優細胞減滅(腫瘤<1 cm)或次優細胞減滅(腫瘤>1 cm)。118例EOC患者術后根據美國國家綜合癌癥網絡(national committee on computer network,NCCN)卵巢癌臨床實踐指南[17],完成了至少6個標準療程的卡鉑5.0～7.5曲線下面積(area under curve,AUC)和紫杉醇175 mg·m-2的化療方案,且具有可分析的化療結果數據。當化療完成后>6個月無復發時,視為鉑敏感腫瘤。耐藥患者被定義為原發性化療難治性患者(盡管接受了一線化療,但仍有進展)或化療完成后≤6個月復發。無進展生存(progression-free survival,PFS)期被定義為從初次手術到疾病進展或復發、死亡或仍活著患者的最后隨訪日期的時間。總生存(overall survival,OS)期計算為從手術日期到任何原因死亡的時間,或到2023年1月17日的時間,以先到者為準。

1.3 血清外泌體提取及特征鑒定

通過血清總外泌體分離試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)分離總外泌體。2 000 r·min-1離心30 min,以去除細胞和細胞碎片,取上清液與總外泌體分離試劑在4 ℃孵育30 min,10 000 r·min-1離心10 min,棄上清,將外泌體顆粒重懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中。通過透射電子顯微鏡(日本JEOL JEM-2100Plus)觀察分離的外泌體形態,粒徑分布使用納米顆粒跟蹤分析儀(英國馬爾文NanoSight LM10)檢測。提取的外泌體質量通過蛋白免疫印跡法驗證,使用外泌體標志物CD63作為陽性指標,Calnexin蛋白作為陰性對照,抗體均購自英國Abcam公司。

1.4 血清外泌體miR-200c水平檢測

使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從外泌體顆粒中提取總RNA。分離RNA的純度由Nanodrop ND-1000分光光度計測定(美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)對提取的RNA進行逆轉錄得到互補DNA。在美國Bio-Rad C1000 Touch實時PCR系統上進行實時熒光定量PCR(qPCR)擴增:95 ℃下進行10 min,95 ℃下進行10 s,60 ℃下進行60 s,共進行40個循環。以U6為內參,采用2-ΔΔCt法計算miR-200c相對表達水平。引物序列:miR-220c正向引物序列5′-CTCGTCTTACCCAGCAGTGTT-3′,反向引物序列5′-CTCCATCATTACCCGGCAGT-3′;U6正向引物序列5′-AGAAGATTAGCATGGCCCCT-3′,反向引物序列5′-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.5 組織NRP1表達檢測

手術時收集所有組織樣本,進行免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色分析。將FFPE組織切片(約4 μm厚)用二甲苯脫蠟,在分級乙醇中再水化。將切片置于pH 9.0的乙二胺四乙酸溶液內,在95 ℃水浴進行30 min抗原修復。用3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶。將組織用5%山羊血清(美國Dako公司)封閉,依次用一抗(NRP1抗體,ab81321,英國Abcam公司)在4 ℃孵育過夜,二抗在室溫下孵育1 h,二氨基聯苯胺顯色溶液孵育10 min。切片用蘇木精溶液復染,DPX封片,用日本Nikon H600L顯微鏡觀察。由兩名病理學專家對染色圖像進行獨立評估,并根據染色強度和染色細胞的比例使用半定量綜合評分法進行量化:免疫反應性評分(immune reactivity score,IRS)取決于染色強度(stain index,SI)和陽性細胞的百分比(positive cell percentage,PP),IRS=SI×PP。SI:無色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。PP:陰性細胞為0分,陽性細胞≤10%為1分,陽性細胞11%～50%為2分,陽性細胞51%～100%為3分。IRS:≤1分為陰性表達,>1分為陽性表達。

1.6 統計學處理

使用SPSS26.0軟件處理數據。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗進行正態性檢驗,偏態分布數據以中位數(M)和四分位數間距(IQR)表示,并進行Mann-WhitneyU分析。二分類變量以率或構成比表示,并進行卡方檢驗。使用受試者共作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析血清外泌體miR-200c對EOC患者鑒別診斷以及化療反應的預測價值。使用Cox風險比例回歸模型和Kaplan-Meier法生存曲線分析血清外泌體miR-200c與預后的關系,并進行Log-rank檢驗。雙側P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清外泌體獲取及鑒定

血清中分離出的囊泡大小約為100 nm(圖1),通過透射電子顯微鏡觀察顯示單層膜囊泡,呈典型的圓盤狀;納米跟蹤分析儀顯示囊泡直徑平均為100 nm。為了確認提取的外泌體質量,對外泌體特征蛋白CD63和Calnexin的表達進行了蛋白免疫印跡分析,結果顯示外泌體標記CD63呈陽性表達,Calnexin呈陰性,表明外泌體確實已充分純化。

A.透射電鏡觀察;B.納米粒徑追蹤分析外泌體粒徑分布;C.外泌體標志膜蛋白CD63和Calnexin表達

2.2 組織中NRP1表達

經IHC分析,NRP1主要表達于EOC腫瘤細胞的胞核和胞質中,偶見于癌旁正常卵巢組織和良性腫瘤組織微血管內皮細胞的胞漿中,見圖2。與良性腫瘤組織(n=30)相比,EOC組織(n=135)中NRP1蛋白陽性表達率更高[42.22%(57/135)vs. 6.67%(2/30),χ2=13.509,P=0.000 2];EOC組織中NRP1蛋白陽性表達率高于癌旁正常卵巢組織[60.42%(29/48vs. 10.42%(5/48),χ2=26.231,P<0.001)]。

A.癌旁正常卵巢組織;B.良性腫瘤組織;C.EOC組織

2.3 兩組血清外泌體miR-200c表達差異

與良性腫瘤組患者相比,EOC組患者血清外泌體miR-200c表達水平顯著降低[0.42(0.35,0.60)vs.0.97(0.85,1.08),Z=-8.255,P<0.001],見圖3A。ROC曲線(圖3B)顯示,血清外泌體miR-200c水平可良好地區分EOC組和良性腫瘤組,曲線下面積(AUC)為0.955(95%CI0.921～0.989),在最佳臨界值(0.78)時,其靈敏度和特異度分別達到0.867(95%CI0.831～0.897)和0.933(95%CI0.917～0.947)。

A.箱式圖;B.ROC曲線

2.4 EOC患者血清外泌體miR-200c表達與組織NRP1表達的關系

NRP1陽性患者血清外泌體miR-200c表達水平顯著低于陰性患者[0.36(0.26,0.43)vs.0.50(0.40,0.72),Z=-5.591,P<0.001]。血清外泌體miR-200c水平與組織NRP1表達呈負相關(Spearman’sr=-0.483,P<0.001)。

2.5 EOC患者血清外泌體miR-200c水平與其他臨床病理特征關系

根據血清外泌體miR-200c表達中位值,將所有EOC患者分為miR-200c低表達組(<0.42)和高表達組(≥0.42)。EOC患者血清外泌體miR-200c低表達與FIGO分期更高、NRP1陽性表達有關(P<0.05),與其他臨床特征和手術結局無關(P>0.05),見表1。

表1 血清外泌體miR-200c水平與EOC患者臨床病理特征的關系 例

2.6 血清外泌體miR-200c水平與化療反應的關系

118例患者完成術后輔助標準化療后,83例化療敏感,35例化療耐藥(31例化療完成后≤6個月復發,4例為原發性化療難治)。化療耐藥組患者血清外泌體miR-200c表達水平顯著低于化療敏感組[0.35(0.24,0.40)vs. 0.52(0.42,0.67),Z=-5.930,P<0.001],見圖4A。血清外泌體miR-200c水平預測EOC患者化療反應的AUC為0.846(95%CI0.769～0.924),對應臨界值為0.41,最佳靈敏度和特異度分別為0.795(95%CI0.769～0.824)和0.829(95%CI0.804～0.840),見圖4B。

A.箱式圖;B.ROC曲線

2.7 預后分析

將單因素分析中P<0.05的變量作為自變量進一步納入多因素Cox回歸分析,預后作為因變量(生存/無進展賦值為0,死亡/疾病進展賦值為1)。多因素Cox回歸分析結果顯示,血清外泌體miR-200c低表達是EOC患者OS和PFS預后的獨立影響因素(P<0.05),見表2。

2.8 Kaplan-Meier生存曲線

血清外泌體miR-200c低表達組和高表達組患者5年OS率分別為49.3%(33/67)和70.6%(48/68),中位OS期分別為21.90、27.13個月(Log-rankχ2=10.192,P=0.001),見圖5A。血清外泌體miR-200c低表達組和高表達組患者5年PFS率分別為16.4%(11/67)和33.8%(23/68),中位PFS期分別為14.90、19.23個月(Log-rankχ2=7.987,P=0.005),見圖5B。血清外泌體miR-200c高表達組OS和PFS預后明顯優于低表達組(P<0.05)。

A.血清外泌體miR-200c表達與OS的關系;B.血清外泌體miR-200c表達與PFS的關系

3 討 論

在過去幾十年中,手術和化療方案的進步使OC的死亡率呈下降趨勢,但它仍然是全球所有婦科惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥[1-2]。化療耐藥已成為EOC有效治療的阻礙[5]。因此,需要尋找有助于監測化療反應和預測患者生存率的新型可靠生物標志物。許多證據表明血清外泌體miRNA在各種癌癥(包括EOC)中作為生物標志物的潛力[7-8]。在本研究中,我們評估了EOC患者血清外泌體miR-200c水平的臨床意義,并證明血清外泌體miR-200c與組織NRP1呈負相關,可以作為預測EOC化療反應和預后的有希望的生物標志物。

越來越多的證據表明,miR-200c的異常表達參與EOC的發生以及化療耐藥性[10-11]。miR-200c是miR-200家族的成員,可參與多種生物過程如細胞周期、血管生成和上皮間質轉化[18]。據報道,它在EOC中高表達,可能有助于上皮間質轉化、侵襲性、腫瘤生長和轉移[11]。另外,miR-200c的丟失與不同類型癌癥(包括EOC)對各種化療藥物的獲得耐藥性有關,是各種癌癥化療耐藥性的重要且有前途的調節劑[10,12]。例如,Vescarelli等[11]報道miR-200c的過表達通過調節NRP1表達逆轉了OC細胞對奧拉帕尼的耐藥性。NRP1是一種跨膜糖蛋白,已被證明通過激活血管內皮生長因子、磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶 B通路在腫瘤發生、癌癥侵襲和血管生成中發揮關鍵作用[13-14]。據報道,NRP1在EOC中表達上調,可通過逃避接觸抑制促進EOC無限生長,并且其高表達與EOC較短的生存期相關[11]。一項全面的生物信息學網絡分析表明,NRP1參與OC的多藥耐藥性[15]。miR-200家族的一些miRNA已被證明與NRP1 3′非翻譯區相互作用,并負調節NRP1信號傳導[11]。此外,Huang等[10]發現miR-200c可通過調節壽命蛋白水平增加EOC細胞對順鉑治療的敏感性。其他研究也報告了EOC中miR-200c表達與紫杉醇和卡鉑耐藥性之間的相關性[12],上述研究證實了miR-200c是EOC化療耐藥性的重要影響因素。此外,許多研究提示miR-200c表達失調與EOC侵襲性和預后不良有關[19-20]。總之,這些研究結果提示miR-200c參與調節EOC化療耐藥,并且與EOC進展和預后密切相關。

最近的研究表明,血清外泌體miRNA在EOC中異常表達,有希望作為EOC的發生和進展的生物標志物[6-7]。而在本研究中,我們發現化療耐藥患者血清外泌體miR-200c水平低于化療敏感患者,提示術前血清外泌體miR-200c低表達與化療耐藥有關,也證明了miR-200c是EOC化療耐藥的相關因素。而且血清外泌體miR-200c水平在區分化療耐藥患者和化療敏感性患者方面具有顯著的預測價值。此外,本研究還發現 NRP1陽性患者血清外泌體miR-200c表達水平顯著低于陰性患者,血清外泌體miR-200c表達與組織NRP1表達之間呈負相關。因此,我們推測血清外泌體miR-200c可能通過靶向NRP1影響EOC化療耐藥,miR-200c/NRP1軸可能是該腫瘤潛在有價值的治療靶點。此外,Cox回歸分析顯示,血清外泌體miR-200c低表達是EOC患者OS和PFS預后不良的獨立危險因素,且血清外泌體miR-200c低表達的患者比高表達的患者具有更短的PFS期和OS期,這提示了血清外泌體miR-200c低表達在評估EOC患者預后不良中的潛在作用。總之,本研究結果提示血清外泌體miR-200c有希望用于篩查化療耐藥高危風險患者和預測EOC患者的預后,以及用于靶向治療。

綜上,本研究表明血清外泌體miR-200c低表達與組織NRP1高表達、化療耐藥及預后不良有關。血清外泌體miR-200c可用作預測EOC化療反應和預后的有希望的生物標志物。但本研究有幾個局限性,例如本單中心研究中應用的樣本量是有限的,而且缺乏機制研究。因此,有必要研究miR-200c在EOC細胞系中的調節機制,并在更大的患者隊列中擴大和證實上述觀察結果。