非小細(xì)胞肺癌患者抗PD-L1治療前后NK細(xì)胞動態(tài)變化與治療反應(yīng)性的相關(guān)性

宋娟麗,王志芬,冀青青,劉崢

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院 腫瘤三科,河北 邯鄲 056000)

原發(fā)性肺癌是我國惡性腫瘤中最常見的一類,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)發(fā)生率較高,雖然目前手術(shù)治療是NSCLC患者根治的唯一手段,但是針對中晚期失去手術(shù)機(jī)會的患者,免疫治療是患者獲得更長生存周期的重要手段[1-2]。目前國內(nèi)外各種共識及指南中均提示,對于晚期失去手術(shù)機(jī)會的NSCLC患者,抗程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)聯(lián)合化療能夠使患者生存周期延長[3-4]。由于免疫靶向治療成本較高,且受個體差異影響較大,導(dǎo)致免疫治療反應(yīng)性差異較大,對于免疫治療效果不佳患者應(yīng)當(dāng)盡早更換抑制藥物及增加其他治療方案,故對于治療反應(yīng)性的預(yù)測性分析有助于制定干預(yù)方案,降低花費(fèi)的同時使患者能盡早達(dá)到預(yù)計療效[5]。

PD-L1是PD-1的受體,二者在體內(nèi)結(jié)合后可以導(dǎo)致T細(xì)胞免疫功能抑制,從而抑制機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的功能,由此可見,對T細(xì)胞的影響是PD-1/PD-L1作用的主要靶點(diǎn)[6]。自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是與T細(xì)胞及B細(xì)胞同源性的淋巴細(xì)胞,在體內(nèi)承擔(dān)非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的角色,其含量與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有顯著的相關(guān)性[7]。本研究采用NK細(xì)胞動態(tài)變化情況作為免疫治療反應(yīng)性的預(yù)測因子,旨在為中晚期NSCLC患者的治療方案制定提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年3月至2021年12月于我院確診的NSCLC患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 符合《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范2018版》[8]中對于NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn),且分期為Ⅲ期及以上,不能通過手術(shù)治療;(2) 年齡≥18周歲;(3) 符合《中國非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療專家共識(2020年版)》[9]中推薦進(jìn)行抗PD-L1治療的條件;(4) 患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1) 合并有其他惡性腫瘤疾病;(2) 對于使用的抗PD-L1治療藥物不耐受;(3) 既往長期使用免疫抑制劑,且治療前1個月內(nèi)未停藥;(4) 預(yù)計生存周期不超過6個月;(5) 嚴(yán)重的全身性慢性疾病;(6) 既往進(jìn)行過NSCLC免疫治療。符合上述條件,并報我院倫理委員會審核通過后共計納入患者100例。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 參照文獻(xiàn)[9]中推薦的方案,采用阿替利珠單抗注射液(廠家:瑞士羅氏制藥有限公司,批號:S20200004)1 200 mg靜脈滴注, 1次·(3周)-1, 4次注射為1個療程,期間需要聯(lián)合含鉑類藥物如順鉑、卡鉑等進(jìn)行雙藥化療,根據(jù)患者病灶組織學(xué)特點(diǎn)按照文獻(xiàn)[8]中相關(guān)推薦,選擇紫杉醇類、吉西他濱及培美曲塞等化療藥物及抗血管生成藥物貝伐珠單抗聯(lián)合抗腫瘤治療。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 采用賽默飛世爾公司提供的Attune NxT流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,主要對患者外周血中的輔助T(helper T,Th;CD3+CD4+)細(xì)胞、細(xì)胞毒性T(cytotoxic T,Tc;CD3+CD8+)細(xì)胞、B(CD19+)細(xì)胞及NK(CD16+CD56+)細(xì)胞進(jìn)行分析。分別于治療前1周及1個療程后3 d內(nèi)抽取患者空腹靜脈血,置于EDTA抗凝管內(nèi)混勻,常溫保存24 h內(nèi)必須完成檢測。檢測步驟:移液槍取50 μl抗凝管內(nèi)全血放置于淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)微球管底部,過程中移液槍頭不接觸管底,同時保證樣本均位于管底;向管底部加入20 μl熒光抗體試劑,渦動混勻10 s后在避光室溫下放置20 min,而后加入450 μl溶血劑后再次放置10 min,最后加入450 μl PBS后上機(jī)檢測。

1.2.3 治療反應(yīng)判斷 治療療程結(jié)束后參照文獻(xiàn)[10]中對腫瘤臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn),結(jié)局分為完全緩解(complete remission,CR)、部分緩解(partial remission,PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease,SD)及疾病進(jìn)展(progressive disease,PD),將CR+PR+SD記為疾病控制(disease control,DC)。

1.2.4 觀察指標(biāo) (1) 一般資料:年齡、性別構(gòu)成、BMI、吸煙史、基礎(chǔ)疾病、既往治療方案及療效、末次治療間隔時間、本次治療方案。(2) 實(shí)驗(yàn)室檢查資料:治療前1周及治療完成后3 d中性粒細(xì)胞絕對值(absolute neutrophil counts,ANC)、淋巴細(xì)胞絕對值(absolute lymphocyte counts,ALC)、血小板(platelet,PLT)及流式細(xì)胞檢測結(jié)果,并計算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、血小板與淋巴細(xì)胞比值(platelet-to-lymphocyte ratio, PLR);治療前PD-L1陽性表達(dá)情況、病理類型及基因檢測結(jié)果。

1.2.5 治療前后指標(biāo)動態(tài)變化情況 對治療后組間存在顯著差異的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行差值(治療前-治療后)及比值(治療前/治療后)的計算作為該指標(biāo)治療前后動態(tài)變化情況的體現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件。計數(shù)資料以n(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),等級資料采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn);計量資料以M(Q25,Q75)表示,組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);通過Logistic回歸分析NSCLC患者治療反應(yīng)性的相關(guān)因素;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分組情況及兩組患者一般資料比較

截止于2022年6月30日,納入治療的100患者中4例轉(zhuǎn)院,3例途中放棄治療,其余患者均進(jìn)行至少1個療程標(biāo)準(zhǔn)治療方案,故最終納入研究的患者共計93例。納入研究的患者中,CR 1例,PR 20例,SD 46例,PD 26例,最終分為DC組67例,PD組26例,兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

DC組患者治療后NLR低于PD組,而治療后NK細(xì)胞高于PD組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。計算兩組患者治療前后NLR及PD動態(tài)變化情況,結(jié)果顯示,兩組患者治療前后NLR比值及差值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=1.632、1.498,P=0.102、0.134);DC組患者治療前后NK細(xì)胞差值及治療前后比值均明顯低于PD組(U=-1.963、-2.005,P=0.049、0.045),見表3。

表2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

表3 兩組治療前后指標(biāo)動態(tài)變化情況比較

2.3 NSCLC患者免疫治療效果影響因素分析

以治療后反應(yīng)性作為因變量,將PD-L1陽性表達(dá)情況(1=“<1%”;2=“1%～49%”;3=“≥50%”)、治療后NLR(實(shí)測值)、NK細(xì)胞治療前后差值(實(shí)測值)及NK細(xì)胞治療前后比值(實(shí)測值)指標(biāo)作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,方法選擇向前、有條件,結(jié)果顯示,治療后NLR、NK治療前后比值、PD-L1是影響NSCLC患者免疫治療效果的獨(dú)立因素(P<0.05),見表4。

表4 NSCLC患者免疫治療效果影響因素分析

2.4 NK治療前后比值與NSCLC患者免疫治療反應(yīng)性相關(guān)性的限制性立方樣條分析

回歸結(jié)果應(yīng)用限制性立方樣條分析,在調(diào)整變量“NLR治療前后比值、PD-L1表達(dá)水平”后得出:隨著NK治療前后比值升高,NSCLC患者治療反應(yīng)為PD的風(fēng)險呈升高趨勢(非線性=0.376,P=0.099),見圖1。

圖1 基于限制性立方樣條模型分析NK治療前后比值與PC患者免疫治療反應(yīng)性相關(guān)性

3 討 論

免疫治療對中晚期NSCLC患者延長生存周期、改善生存狀態(tài)的作用相較于傳統(tǒng)的化療效果更佳,但不能忽視的是開始免疫治療后患者出現(xiàn)的不良反應(yīng)也相對較多,對于臨床醫(yī)生需要充分權(quán)衡利弊后方可開展免疫治療[1]。由此引申出對于中晚期NSCLC患者進(jìn)行免疫治療效果的預(yù)測分析在臨床工作中的重要性,雖然在既往研究中已經(jīng)指出,基因分型、TNM分期等多個臨床常用指標(biāo)對于免疫治療效果具有一定的預(yù)測價值,但上述指標(biāo)評價相對復(fù)雜,且由于NSCLC患者在開展免疫治療后機(jī)體內(nèi)發(fā)生顯著變化會導(dǎo)致單一的治療前預(yù)測指標(biāo)與現(xiàn)實(shí)情況存在偏差[11-12]。免疫治療周期較長,故在開始治療早期發(fā)現(xiàn)患者反應(yīng)性較差可能對于后續(xù)治療方案的制定具有較好的臨床使用價值。

本研究中PD率為27.95%,而在文獻(xiàn)[13]中PD率為43.91%,本研究相對較低,通過對比兩次研究差異發(fā)現(xiàn),首先本研究開展時疾病治療周期較短,僅為3個月,而Nelli等[13]統(tǒng)計了至少治療6個月以上患者,甚至最長時間超過2年。NSCLC晚期隨著病程延長,PD的可能性也相對較大,這是導(dǎo)致差距的主要原因[14]。比較不同反應(yīng)性患者相關(guān)指標(biāo),結(jié)果顯示,兩組患者治療后NLR、NK細(xì)胞數(shù)具有顯著差異,NLR是反映臨床炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo),通常情況下其值越高說明體內(nèi)中性粒細(xì)胞分化越強(qiáng),也意味著炎癥反應(yīng)更加劇烈[15-16]。值得關(guān)注的是,在腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的機(jī)制中,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)是重要的影響因素之一,這一點(diǎn)在夏經(jīng)緯等[17]的研究中已經(jīng)得到了證實(shí),該研究還提出了治療過程中NLR升高與PD-1治療有效性呈負(fù)相關(guān),而本研究也得到了相似的結(jié)論,治療過程中NLR升高與PD-L1抑制治療短期反應(yīng)性較好呈負(fù)相關(guān)。

PD-L1屬于B7家族成員,廣泛表達(dá)于機(jī)體各類免疫細(xì)胞內(nèi),其中NK細(xì)胞是PD-L1主要表達(dá)的細(xì)胞之一,PD-1/PD-L1是機(jī)體內(nèi)維持免疫平衡的重要負(fù)性共刺激分子,具有抑制免疫反應(yīng)、調(diào)控免疫耐受的作用[18-19]。目前國內(nèi)外研究中,PD-1/PD-L1被證實(shí)是卡控體內(nèi)免疫細(xì)胞的重要點(diǎn)位,能從多個環(huán)節(jié)和信號通路向T細(xì)胞傳遞抑制性信號,從而達(dá)到抑制細(xì)胞反應(yīng)、促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的重要作用[20]。而在國外的基礎(chǔ)研究中提示,當(dāng)NK細(xì)胞表面PD-1/PD-L1表達(dá)陽性時其細(xì)胞增殖、毒性及細(xì)胞因子分泌功能均受到不同程度的削弱[21-22]。由此可見,PD-1高表達(dá)是會導(dǎo)致NK細(xì)胞功能缺如,這可能是PD-1導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸的另一重要途徑。本研究結(jié)果顯示,DC患者中NK細(xì)胞含量高于PD患者,結(jié)合之前對PD-1/PD-L1與NK細(xì)胞之間關(guān)系的研究,認(rèn)為主要原因是患者對PD-L1抑制劑反應(yīng)效果不佳,導(dǎo)致體內(nèi)PD-1/PD-L1表達(dá)狀態(tài)較高,從而導(dǎo)致NK細(xì)胞分化、增殖及清除腫瘤細(xì)胞功能受到抑制,而PD患者NK細(xì)胞數(shù)量較低,就是NK細(xì)胞分化增殖功能抑制的重要表現(xiàn)。

對于NLR及NK細(xì)胞治療前后的動態(tài)分析顯示,治療前后NLR及NK細(xì)胞比值與PC患者短期治療反應(yīng)性之間存在顯著的相關(guān)性,且為獨(dú)立影響因素,而將治療后NLR及NK細(xì)胞值以及治療前后NLR及NK細(xì)胞差值排除獨(dú)立因素范疇。首先需要明確的是治療前后的NLR及NK值有較大可能性受到基線指標(biāo)的影響;其次治療前后的差值在消除基線資料影響的效果上是明顯差于治療前后比值,故最終僅有治療前后NLR及NK細(xì)胞比值成為影響NSCLC患者免疫反應(yīng)性的獨(dú)立因素。在隨后的RCS分析中,NK細(xì)胞治療前后比值與患者治療反應(yīng)呈非線性相關(guān),這說明可以進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取后制定NK細(xì)胞治療前后比值對患者治療反應(yīng)的預(yù)測臨界值,從而制定陽性標(biāo)準(zhǔn),優(yōu)化檢測流程,降低醫(yī)療成本。

另外,本研究中PD-L1表達(dá)情況也與患者治療反應(yīng)具有顯著的相關(guān)性,這一點(diǎn)毋庸置疑,PD-L1表達(dá)情況一直以來是評價患者使用PD-1及PD-L1抑制劑的重要指標(biāo),雖然在指南[9]中對于晚期NSCLC患者開展免疫治療的評估中并未包含此項(xiàng)指標(biāo),近年來國內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果均支持PD-L1≤1%患者采用免疫治療效果不理想的結(jié)論,但目前臨床上晚期NSCLC治療方式相對缺乏,故通常采用PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合化療、血管抑制治療等控制患者病情[23]。故對于晚期NSCLC的治療方式還有待進(jìn)一步完善。

本研究的優(yōu)勢在于采用了目前臨床上相對較易獲得的指標(biāo)對NSCLC免疫治療反應(yīng)性進(jìn)行預(yù)測,可以降低醫(yī)療成本,對于晚期NSCLC患者治療方案制定具有一定的指導(dǎo)作用。但不足也較明顯:一是由于時間限制,本研究并未對患者長期預(yù)后進(jìn)行分析;二是由于經(jīng)費(fèi)限制,本研究為單中心小樣本量研究;三是由于疾病的特殊性,本研究在制定納入及排除標(biāo)準(zhǔn)時進(jìn)行了適當(dāng)?shù)姆潘伞Ｒ陨先c(diǎn)原因均有一定的可能性導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏倚,從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,這些不足將在今后開展相關(guān)研究時盡量避免,同時筆者也會在本研究的基礎(chǔ)上,針對NK細(xì)胞動態(tài)變化與晚期NSCLC患者免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性進(jìn)行更加全面的評估,進(jìn)一步完善相關(guān)結(jié)論,指導(dǎo)臨床治療。