HSPA1A受HOTAIR/miR-590-3p軸調控促進I/R誘導的心肌梗死大鼠體內NF-κB介導的炎癥反應

急性心肌梗死(AMI)是嚴重的心血管疾病,是全球心血管疾病相關死亡的主要原因[1-2]。治療AMI的主要方法是溶栓和經皮冠狀動脈介入治療(PCI),但PCI可能會導致心肌缺血再灌注(I/R)損傷,進而引起諸多不良反應[3]。因此仍需深入研究AMI更確切的發展機制。核因子-κB(NF-κB)信號通路是I/R誘導的AMI心肌細胞炎癥損傷中的關鍵角色[4]。最新研究表明,熱休克70 kDa蛋白1A(HSPA1A)在AMI小鼠心肌組織中表達明顯上調[5],然而HSPA1A的激活是否積極參與調控AMI的炎癥反應還不清楚。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種超過200個核苷酸的非編碼RNA,對基因表達調節具有重要作用[6]。在I/R過程中,許多lncRNA高溫轉錄物反義RNA(HOTAIR)出現異常表達,并調控心肌炎癥損傷[7]。微小RNA(miRNA)在心血管疾病和心肌I/R損傷中也發揮著重要作用,如miR-590-3p可以抑制心肌組織中的炎癥反應[8]。本研究旨在研究HSPA1A在AMI大鼠炎癥反應中的作用,并探討是否被HOTAIR和miR-590-3p密切調控從而介導心肌I/R損傷和炎癥反應。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司。TRIzol?試劑購于日本TaKaRa Biotechnology公司。Quant One Step 實時定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購于北京天根生物科技公司。Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司。H9C2細胞購于武漢普諾賽生物公司。miR-590-3p擬似物(mimic)、mimic的陰性對照(mimic-NC)、過表達重組質粒(pcDNA3.0)-HSPA1A(pc-HSPA1A)、小干擾RNA重組質粒(siRNA)-HSPA1A(si-HSPA1A)、si-HSPA1A陰性對照(si-NC)、小干擾RNA重組質粒(siRNA)-HOTAIR(si-HOTAIR)、si-HOTAIR陰性對照(si-NC2)均購于上海吉凱基因醫學科技公司。兔抗-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、HSPA1A、NF-κB P65、磷酸化的NF-κB P65(p-NF-κB P65)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的一抗和辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔免疫球蛋白 G(IgG)的二抗均購于美國Abcam公司。pGL3雙熒光素酶miRNA-基因表達載體購于美國Promega公司。

1.2 I/R大鼠模型建立和分組

36只新生斯普拉格-杜勒(SD)大鼠(1～2日齡)由新疆醫科大學實驗動物中心提供。I/R損傷模型的建立參照既往研究。大鼠術前禁食12 h,用水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉。大鼠以仰臥位固定,四肢連接12導聯心電圖。氣管與頸部分離,使用呼吸機保持大鼠呼吸順暢[呼吸頻率60次·min-1,氣流速率2 ml·(100 g)-1],胸骨左側第3肋間隙沿縱隔切開心包。用2～3 mm縫合針插入左心耳,結扎下放置直徑1.5 mm的乳膠管。結扎收緊,造成心肌缺血,阻斷冠狀動脈血流。30 min后松開結扎,血流灌注2 h,形成I/R損傷模型。所有實驗均經我院倫理委員會批準。

為研究HOTAIR和HSPA1A對I/R大鼠心肌損傷和炎癥因子的影響將新生大鼠分為6組:假手術組,僅開胸骨左側第3肋間隙后直接縫合;I/R組,按照上述造模方法行I/R造模,造模2 h開始靜脈注射2 ml生理鹽水,1次·d-1,持續1周;I/R+si-NC組,I/R造模后2 h開始靜脈注射5 mg·kg-1si-NC,1次·d-1,持續1周;I/R+si-HSPA1A組,I/R造模后2 h開始靜脈注射5 mg·kg-1si-HSPA1A,1次·d-1,持續1周;I/R+si-HOTAIR組,I/R造模后2 h開始靜脈注射5 mg·kg-1si-HOTAIR,1次·d-1,持續1周;I/R+si-NC2組,I/R造模后2 h開始靜脈注射5 mg·kg-1si-NC2,1次·d-1,持續1周。各組處理完成后讓大鼠安樂死,分離心肌組織和血清,保存于-80 ℃。

1.3 體外缺氧/復氧(H/R)心肌細胞模型建立和分組

大鼠心肌來源的H9C2細胞系來源于中國科學院細胞庫(中國,上海)。H9C2細胞在含有10%胎牛血清(95%空氣,5% CO2, 37 ℃)的杜氏改良培養基(DMEM)中培養。培養48 h后,將H9C2細胞暴露在含1% O2、94% N2和5% CO2的氣體中24 h,然后將細胞置于常規培養箱(95%空氣、5% CO2、37 ℃)中維持12 h,建成H/R H9C2細胞模型。

為研究HOTAIR和HSPA1A對H/R細胞炎癥反應的影響,將H9C2細胞分為4組:Ctrl組,95%空氣,5% CO2, 37 ℃持續培養;H/R組,將細胞暴露在含1% O2、94% N2和5% CO2的氣體中24 h,然后在95%空氣、5% CO2、37 ℃培養12 h;H/R+si-HSPA1A組,同H/R組的培養條件,且H/R模型誘導的培養基中含2 μg·ml-1si-HSPA1A和1% Lipofectamine 3000;H/R+si-HSPA1A+pc-HSPA1A組,同H/R組的培養條件,且H/R模型誘導的培養基中含2 μg·ml-1si-HSPA1A、2 μg ·ml-1pc-HSPA1A、1% Lipofectamine 3000。收集各組細胞保存于-80 ℃。

為研究H9C2細胞中miR-590-3p對HSPA1A表達的調控以及HOTAIR對miR-590-3p表達的調控作用,將H9C2細胞分為4組:mimic-NC組,常規培養,且培養基中含0.5 mg·ml-1mimic-NC和1% Lipofectamine 3000;mimic組,常規培養,且培養基中含0.5 mg·ml-1mimic和1% Lipofectamine 3000;si-NC2組,常規培養,且培養基中含0.5 mg·ml-1si-NC2和1% Lipofectamine 3000;si-HOTAIR組,常規培養,且培養基中含0.5 mg·ml-1si-HOTAIR和1% Lipofectamine 3000。各組培養36 h后收集細胞保存于-80 ℃。

1.4 Western blot

將1.2中保存的心肌組織和1.3中保存的H9C2細胞置于裂解緩沖液中裂解30 min(4 ℃)。1.0 mg總蛋白通過10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后轉移到硝化纖維膜。用5%脫脂牛奶封閉膜。心肌組織使用兔抗-HSPA1A(1∶600)、NF-κB P65(1∶1 000)、p-NF-κB P65(1∶1 000)的一抗進行孵育;心肌細胞使用兔抗-HSPA1A(1∶600)、IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)的一抗進行孵育;內參蛋白均為GAPDH。然后,將膜與HRP山羊抗兔IgG(1∶20 000)進行孵育。蛋白通過薄膜掃描儀檢測。用Image-pro Plus 6.0凝膠圖像處理系統分析條帶的灰度值。

1.5 HE染色

將保存的心肌組織用10%甲醛固定,石蠟包埋保存。切4 μm厚切片,放于載玻片上。脫蠟后經過逐漸降低酒精濃度的脫水過程(100%、95%、70%、50%乙醇),最后放入蒸餾水中洗滌10 min。將載玻片放入蘇木素染液中染色10 min,使用1%酸性酒精進行脫色,直至顏色清晰;經過漂洗之后,將載玻片放入伊紅溶液中染色3 min。最后經過脫水、清洗及封片,在顯微鏡下觀察獲取圖片。

1.6 ELISA

按照ELISA試劑盒供應商提供的方案,檢測心肌組織CK-MB、CTNI的表達以及血清IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

心肌組織和H9C2細胞中的RNA樣品采用TRIzol?試劑進行分離,應用Bio-Rad CFX96 PCR系統和Quant One Step RT-qPCR試劑盒進行RT-qPCR反應。循環條件為:95 ℃保持30 s,隨后95 ℃保持5 s,60 ℃保持30 s,執行40個循環。所有引物設計如下:HOTAIR:正向5′-ATGGGGTGGAACTCATGATGG-3′,反向5′-AAGAATGGACATCATTTATTTCA-3′; miR-590-3p:正向5′-GCCGGCCTAATTTTATGTATAA-3′,反向5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′;U6: 正向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,反向5′-CGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC-3′;GAPDH: 正向5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,反向5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。HOTAIR的CT值歸一化為GAPDH, miR-590-3p的CT值歸一化為U6,用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測HOTAIR與miR-590-3p以及miR-590-3p與HSPA1A的3′UTR結合作用。通過PCR擴增HOTAIR中包含預測miR-590-3p結合位點的cDNA片段。然后將結合位點的假定序列克隆到pGL3雙熒光素酶miRNA-基因表達載體中,構建報告載體野生型(WT)-HOTAIR。另外使HOTAIR基因中miR-590-3p的結合位點發生突變,命名為突變型(MUT)-HOTAIR。隨后根據制造商的方案,使用Lipofectamine 3000將100 ng WT-HOTAIR或100 ng MUT-HOTAIR分別與mimic轉染的H9C2細胞(5×104個細胞·孔-1)共轉染,或使用Lipofectamine 3000將100 ng WT-HOTAIR或100 ng MUT-HOTAIR分別與mimic-NC轉染的H9C2細胞(5×104個細胞·孔-1)共轉染。

另外,與上述方案一致,構建報告載體pGL3-HSPA1A-3′UTR-wild-type(WT-HSPA1A)。使HSPA1A-3′UTR中miR-590-3p的結合位點發生突變,命名為pGL3-HSPA1A-3′UTR-mut(MUT-HSPA1A)。隨后根據制造商的方案,使用Lipofectamine 3000將100 ng WT-HSPA1A或100 ng MUT-HSPA1A分別與mimic轉染的H9C2細胞(5×104個細胞·孔-1)共轉染,或使用Lipofectamine 3000將質粒100 ng WT-HSPA1A或100 ng MUT-HSPA1A分別與mimic-NC轉染的H9C2細胞(5×104個細胞·孔-1)共轉染。用雙熒光素酶報告系統檢測熒光素酶活性。

1.9 MTT實驗檢測H9C2細胞增殖

按照制造商說明使用MTT試劑盒檢測H9C2細胞的增殖。用酶標儀(Bio-Rad)在490 nm處測量OD值。細胞增殖率=OD實驗組/OD陰性對照組×100%。

1.10 統計學處理

使用GraphPad PRISM 5.01進行數據錄入和統計學分析,正態分布的數據表示為均數±標準差,兩組間比較采用Studentt檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HSPA1A對大鼠心肌I/R損傷和炎癥反應的影響

與假手術組相比,I/R組HSPA1A的蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)(圖1A、表1);與I/R+si-NC組相比,I/R+si-HSPA1A組HSPA1A的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)(圖1A、表1)。HE染色結果顯示,假手術組大鼠心肌細胞結構良好,細胞排列整齊,細胞核完整,細胞質均勻;而I/R組大鼠心肌細胞排列紊亂,出現細胞壞死,炎癥細胞浸潤;I/R+si-NC組與I/R組的組織病理學狀況幾乎相同;與I/R+si-NC組相比,I/R+si-HSPA1A組心肌細胞損傷明顯改善(圖1B),并下調了心肌組織中CK-MB和cTnI的表達(均P<0.05,表1)。

A. Western blot法檢測HSPA1A的蛋白表達;B.HE染色檢測心肌組織病理變化(×200);C.Western blot檢測NF-κB P65和p-NF-κB P65的蛋白表達

表1 I/R大鼠沉默HSPA1A后體內HSPA1A、CK-MB、cTnI、NF-κB P65、p-NF-κB P65相對表達水平和炎癥因子水平的變化(n=6)

與假手術組相比,I/R組NF-κB P65和p-NF-κB P65的表達均顯著上調(均P<0.05),而與I/R+si-NC組相比,I/R+si-HSPA1A組的NF-κB P65、p-NF-κB P65的表達均顯著下調(均P<0.05)(圖1C、表1),血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平均下調(均P<0.05,表1)。

2.2 HOTAIR對miR-590-3p、HSPA1A和I/R大鼠炎癥反應的影響

與I/R+si-NC2組相比,I/R+si-HOTAIR組HOTAIR的表達水平顯著下調(P<0.05),而miR-590-3p的表達水平上調(P<0.05),見表2。HE染色結果顯示,與I/R+si-NC2組相比,I/R+si-HOTAIR組心肌細胞損傷明顯改善(圖2A),I/R+si-HOTAIR組心肌組織中CK-MB和cTnI的表達下調(均P<0.05,表2)。

A.HE染色檢測心肌組織病理變化(×100);B.Western blot檢測HSPA1A、NF-κB P65和p-NF-κB P65的蛋白表達

表2 I/R大鼠沉默HOTAIR后體內HOTAIR、miR-590-3p、CK-MB、cTnI、HSPA1A、NF-κB P65、p-NF-κB P65相對表達水平和炎癥因子水平的變化(n=6)

與I/R+si-NC2組相比,I/R+si-HOTAIR組的HSPA1A、NF-κB P65、p-NF-κB P65的表達均顯著下調(均P<0.05,圖2B、表2),血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平均下調(均P<0.05,表2)。

2.3 HSPA1A與miR-590-3p的靶向關系

雙熒光素酶報告基因實驗檢測發現HSPA1A的3′-UTR可直接結合miR-590-3p(P<0.05,圖3A)。在心肌細胞中,與mimic-NC組相比,mimic組中的HSPA1A蛋白表達明顯下調(P<0.05,圖3B)。

a P<0.05;每組n=3

2.4 HOTAIR作為“分子海綿”吸附miR-590-3p

雙熒光素酶報告基因實驗檢測發現HOTAIR可直接結合miR-590-3p(P<0.05,圖4)。在心肌細胞中,與si-NC2組miR-590-3p表達水平(1.00±0.03)相比,si-HOTAIR組的miR-590-3p表達水平(6.22±1.03)上調,差異有統計學意義(t=263.153,P=0.001)。

a P<0.05;每組n=3

2.5 HSPA1A受HOTAIR/miR-590-3p軸的調控促進I/R大鼠心肌炎癥

為鑒定HSPA1A是否受HOTAIR/miR-590-3p軸的調節而干預心肌細胞炎癥,將si-HOTAIR和HSPA1A過表達質粒(pc-HSPA1A)共轉染到H/R誘導的H9C2細胞中。si-HOTAIR和pc-HSPA1A均表現出優異的轉染效率。MTT實驗顯示,與H/R組相比,H/R+si-HOTAIR組上調了H/R誘導下的H9C2細胞的增殖率(P<0.05,圖5A)。H/R+si-HOTAIR+pc-HSPA1A組的細胞增殖率明顯低于H/R+si-HOTAIR組(P<0.05,圖5A)。與H/R組相比,H/R+si-HOTAIR組顯著降低了H/R誘導的H9C2細胞中HOTAIR、HSPA1A、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(均P<0.05,圖5B～G),而H/R+si-HOTAIR+pc-HSPA1A組則顯著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(均P<0.05,圖5E～G)。

a 與Ctrl組比較,P<0.05;b 與H/R組比較,P<0.05;c 與H/R+siHORAIR組比較,P<0.05

3 討 論

由于AMI的病理特點,應用PCI治療血運重建會伴隨I/R損傷,對損傷的心肌組織造成“二次損傷”,這可進一步導致心律失常、冠狀動脈微循環障礙、心肌組織壞死、心室收縮功能下降等癥狀。目前,I/R損傷的機制包括活性氧(ROS)的過度產生、鈣過載、心肌細胞過度凋亡和炎癥反應[9-10]。因此,減少心肌梗死后心肌細胞炎癥損傷,對改善心肌梗死患者的臨床預后具有重要意義。

根據以往的研究,lncRNA在心血管疾病的進展中起著關鍵作用[11]。lncRNA通常以“分子海綿”的方式調節miRNA靶基因的表達。本研究重點是研究HOTAIR和miR-590-3p在調節心肌I/R炎癥損傷和H/R誘導的心肌細胞增殖活性和炎癥反應中的作用和機制。人類的HOTAIR位于染色體12q13上。基因調控研究發現,HOTAIR通過吸附miRNA從而調控下游癌基因和腫瘤抑制基因的表達[12]。此外,HOTAIR可作為腫瘤發展的致癌基因[13]。研究表明,HOTAIR還是AMI的重要中介物質[14]。在本研究中,我們發現HOTAIR在I/R模型大鼠中高表達,并且人為下調HOTAIR后,I/R的損傷和炎癥反應均明顯被抑制。我們還發現,miR-590-3p表達伴隨著炎癥因子的上調反而在I/R模型中下調。此外,當下調HOTAIR后,miR-590-3p的表達明顯上調。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗,我們證明了HOTAIR可以作為“分子海綿”直接吸附miR-590-3p。此前已有大量研究探討了miR-590-3p與NF-κB信號通路之間的關系。如Zhao等[15]通過在體內靶向NF-κB,發現miR-590-3p是一種新型的心肌炎癥相關的miRNA。此外,Bao等[16]研究還表明,miR-590-3p通過p53/NF-κB通路保護氧化低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞凋亡。而在本研究中我們證明了HOTAIR直接抑制miR-590-3p,并促進I/R心肌組織NF-κB和血清炎癥因子的表達,體外實驗也得到了類似的結果。說明了HOTAIR可以作為“分子海綿”直接吸附miR-590-3p,從而激活NF-κB相關的炎癥反應。

熱休克蛋白(HSPs)是一類受氧化應激、病毒感染、紫外線輻射、乙醇和其他化學物質的作用被誘導表達增高的蛋白,它們主要按分子量命名,如該家族的HSPA1A又名HSP72[17]。HSPA1A能被氧化應激誘導而表達增高,并向細胞外釋放[17]。研究表明AMI患者冠狀動脈血栓的增加與HSPA1A的表達水平呈正相關,而且添加HSPA1A后二磷酸腺苷刺激的血小板聚集顯著增加,也可以被抗HSPA1A的抗體所減少[17]。本研究發現,HSPA1A蛋白在I/R誘導的AMI大鼠心肌組織和H/R誘導的心肌細胞中都顯著上調,因此HSPA1A很可能與調控AMI有關。本研究發生沉默HSPA1A可以負向調節I/R模型大鼠的炎癥反應,抑制NF-κB和磷酸化NF-κB的表達水平,證實了HSPA1A是一種AMI的關鍵調控蛋白,它通過激活NF-κB促進AMI大鼠的心肌損傷和炎癥反應,另外,研究還表明HSPA1A的過表達可以通過促進p-NF-κB P65的表達激活NF-κB信號通路[18],這支持了本研究中沉默HSPA1A對NF-κB P65具有抑制效果的結論。本研究還通過Western blot實驗和雙熒光素酶報告基因實驗,證明了在心肌細胞中存在一種新的靶向關系,即HSPA1A受到miR-590-3p的靶向調控。經驗證,miR-590-3p的mimic可明顯抑制H9C2細胞中HSPA1A的表達。另外,下調HOTAIR后,I/R大鼠心肌組織和H/R心肌細胞中的HSPA1A以及IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白水平均明顯下調。在下調HOTAIR的基礎上繼續上調HSPA1A后,H/R心肌細胞中的IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達反而都顯著上調。以上研究均表明,HSPA1A受HOTAIR/miR-590-3p的靶向調控從而激活NF-κB促進了AMI大鼠的炎癥反應。

綜上所述,本研究證明HOTAIR通過“分子海綿”吸附miR-590-3p從而促進了HSPA1A的表達,而且HSPA1A被HOTAIR/miR-590-3p軸調控從而激活了NF-κB相關的心肌炎癥反應。我們的研究結果表明,靶向HOTAIR/miR-590-3p/HSPA1A軸可能是一種治療AMI的方法。