小麥- 赤霉病菌互作研究進展

程怡璠，沈會權，張英虎，徐 肖，楊紅燕，汪 強，梁志浩，薛 松，于文青，郭愛奎

（江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇 鹽城 224002）

小麥是世界上種植面積最大的糧食作物，種植面積為2.2 億hm2，年產量超過7 億t，為全世界25 億人口提供了約20%的能量和蛋白質[1]。隨著氣候環境的變化，小麥的生產受到越來越多的非生物以及生物脅迫的影響，其中由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等真菌引起的小麥赤霉病（Fasuriumhead blight）是威脅小麥生產的主要病害之一。近年來，因全球氣候變暖、輪作制度等影響，小麥赤霉病在全球小麥種植區流行發生，導致小麥產量下降，同時小麥籽粒受到赤霉病菌產生的真菌毒素的污染，嚴重威脅人類和牲畜的健康。我國長江中下游地區高溫高濕的環境使小麥赤霉病頻發。赤霉病的抗性是淮南地區小麥品種審定的重要評定標準之一：對赤霉病高感的參試品種施行一票否定制[2]。目前生產應用的主栽小麥品種對赤霉病的抗性不穩定。現采用的防治措施仍以化學防治為主，雖然該防治方法快速有效，但存在過度使用化學藥劑的情況，對生態環境的影響和人類健康提出了很大的挑戰。因此，分析小麥- 赤霉病菌互作機制，發掘小麥抗性基因，解析抗性機理，并應用于小麥抗赤霉病育種，才是解決小麥安全生產行之有效的辦法。

小麥赤霉病的肆虐引起了全球小麥育種家的廣泛關注，育種家們通過綜合應用多學科技術來對抗小麥赤霉病。小麥全基因組測序的完成[3]，極大地促進了對控制病原菌生長發育的因素、與寄主抗性相關的基因或染色體區域以及更有效地改良寄主抗性新方法的研究，為所有研究人員提供了一個深入分析六倍體小麥基因的好機會，小麥赤霉病的基礎應用研究、小麥- 赤霉病菌的互作研究都取得了重要進展。本文主要對近年來小麥赤霉病菌的致病機制和小麥- 赤霉病菌互作的分子機制進行總結，并對未來小麥抗赤霉病育種方面的難點問題進行討論，以期為今后的小麥抗赤霉病育種奠定基礎。

1 小麥赤霉病的流行特點和危害

小麥赤霉病是小麥最嚴重的病害之一，在全球普遍發生，被稱為小麥的“癌癥”，危及小麥的產量和品質，產生的毒素進一步危害人畜健康，對糧食安全和食品安全影響極大。近年來，氣候變暖和耕作制度的變化導致小麥赤霉病在全球尤其是我國的發生范圍不斷擴大，特別在我國最大的小麥主產區黃淮麥區，小麥赤霉病呈常發態勢，危害日趨嚴重[1]。

1.1 小麥赤霉病的流行特點

小麥赤霉病俗稱麥穗枯、爛麥頭、紅麥頭，在小麥開花期侵染小麥穗部，盛花期連續的高溫高濕可能會造成小麥赤霉病的流行[2]。小穗被赤霉病菌侵染后，連續36 h 暴露在25 ℃的環境下，其侵染的癥狀會在2 d 左右出現，而在18～20 ℃的條件下癥狀會在3～5 d 首次出現，在15 ℃以下的侵染則可以忽略不計[4]。小麥赤霉病菌主要侵染小麥的穗部和籽粒，在田間接種1 周后的小穗會首先產生褐色的水漬狀斑紋，后期穗部會出現漂白的表型，若在濕度較大的情況下，穎殼會出現粉紅色的真菌[1]，同時籽粒發育會受到影響，病粒會脫色、皺縮、有粉紅色真菌、灌漿不完全。

1.2 小麥赤霉病的流行地區

小麥赤霉病最早于1884 年在英國被記載[5]。Chester 等將赤霉病描述為19 世紀90 年代初影響印第安納州和俄亥俄州小麥生產的一種突出病害[6-7]。第1 次有記錄的大規模小麥赤霉病的暴發是在1914 年的日本[8]。在1917 年的美國，小麥赤霉病蔓延了31 個州，造成了約544 306 t 的損失[9]。20 世紀70 年代，小麥赤霉病主要發生在阿根廷、美國、巴西、中國和日本。此后，全球幾乎每年都會發生小麥赤霉病流行[1]。

歷史上，我國的小麥生產曾遭受赤霉病的嚴重打擊，自1950 年來，我國暴發過30 次小麥赤霉病疫情[1]，每次都有超過1/10 面積的小麥受到影響。我國經常發生小麥赤霉病的地區是長江中下游地區和黑龍江省東部。近幾年，受氣候變暖和耕作制度等影響，小麥赤霉病的發生越來越嚴重，受災地區包括主要的小麥產區黃淮河流域[1]，并且已經蔓延到了更遠的北部和西部。

1.3 小麥赤霉病的危害

赤霉病嚴重威脅小麥安全生產，一般流行年份可引起5%～10%的產量損失，大流行年份可導致部分田塊絕收[10]。小麥赤霉病的流行除了會導致小麥產量的下降，病粒的籽粒中含有的由赤霉病菌產生的主要毒素——脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），還會嚴重影響食品安全。人類或牲畜食用含有該毒素的病粒加工而成的食物，會引起嘔吐等中毒現象，還會造成免疫下降，甚至致畸致癌。這使得這些病粒不適合人類食用，也不適合作為牲畜飼料使用。為了保護消費者免受DON 毒素中毒的影響，許多國家都發布了法規，規定了用于人類食品和動物飼料的成品小麥中允許的DON 水平。我國的衛生和標準管理部門規定，小麥中DON 含量超過1 mg/kg、小麥赤霉病病粒含量超過4%時禁止食用[10]。研究表明，赤霉病發病級別在1 級以上，籽粒中的DON 就會嚴重超標。按國家標準，可供安全食用的小麥病粒率應低于2.58%，這比國家標準中4%的病粒率要低很多。所以，一般認為赤霉病發生會造成嚴重減產，而實際上當病粒率達到一定比例時，收獲的小麥已經不能作為糧食食用，這不是簡單的減產問題，可以認為是絕收[10]。

2 小麥赤霉病菌的致病機制

2.1 小麥赤霉病菌

多種鐮刀菌（也稱鐮孢菌）都會引起小麥赤霉病。Parry 報道在歐洲引起小麥赤霉病的鐮刀菌有17 個[11]。20 世紀50 年代，著名植病學家俞大紱先生從長江流域的小麥種子上分離獲得4 個鐮刀菌的菌種，分別是禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme） 和燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[12]。20 世紀80 年代，我國小麥赤霉病攻關協作組對22 個省市的致病鐮刀菌樣本進行了形態學鑒定，共鑒定出27 個包括變種的鐮刀菌[13]。地域不同，所存在的鐮刀菌的種類不同，我國普遍認為禾谷鐮刀菌是引起小麥赤霉病的主要致病種[12]。但2004 年國外學者發現生物學分類劃分為一個種的禾谷鐮刀菌其實是一個進化的族群，這個族群有清晰的系統發育生物學“種”的界限，且具有明顯的地理分布[14]，被分為了9 個種（部分見表1）[15]，其中過去提到的禾谷鐮刀菌現在只是作為其中一個廣泛分布的種名。有研究表明，在亞洲流行的亞洲鐮刀菌是引起我國麥類作物赤霉病的優勢種群[15-16]。

表1 部分省（直轄市）鐮刀菌種的分布與檢測[15]

2.2 小麥赤霉病菌的致病機制

小麥赤霉病菌在玉米、麥類作物等收獲后的秸稈上以子囊殼形式越冬和越夏，次年小麥揚花期時，在高溫、高濕環境下釋放大量的子囊孢子，初步侵染小麥的穗部組織，其中菌源量、環境濕度、環境溫度與發病程度密切相關[17]。禾谷鐮刀菌為半活體寄生型病原菌[18]，在其侵染植物的早期需要活體組織，即為活體營養階段，隨后切換到腐生營養階段，而從活體寄生到腐生轉換的時間點，大概是在侵染后的48 h[19]。

在大田條件下，空氣傳播的孢子落在開花的小穗上引起小麥赤霉病，開花的小穗為鐮刀菌提供了接觸主要穿透部位的機會。只有在開放的小花中鐮刀菌才能接觸到發育中的穎果以及內稃和外稃的正面，而這些部位更容易受到鐮刀菌的侵染[20]。大多數鐮刀菌會通過氣孔等自然的開口，或者較短的侵染菌絲穿透小麥的細胞壁進入小麥的外殼[21]，但也有可能在小麥穎片上進行初步侵染[22]。Kang 等研究認為，禾谷鐮刀菌以直接侵入的方式穿透表皮細胞進入寄主組織內[23]。蘇培森等通過掃描電子顯微鏡在抗病和感病品種的穎殼和葉片中分析禾谷鐮刀菌的侵染模式，發現在接種12 h 后感病品種的穎殼表面已經形成菌絲[24]。Pritsch 等認為，鐮刀菌是在氣孔開口處對小麥進行侵染，他們在小麥開花期使用噴霧接種赤霉病菌后，將感病材料Wheaton 和抗病材料蘇麥3 號取穎片樣本在掃描電子顯微鏡（SEM）和光學顯微鏡下進行觀察，發現穎片背面在接種后6～12 h 萌發禾谷鐮刀菌的大分生孢子；在12～24 h 就已經很明顯地看到菌絲，且初生菌絲均勻細長，最初不分支，頻繁地接觸氣孔，由此Pritsch 等認為禾谷鐮刀菌穿透事件可能通過這些氣孔等開口發生；在48～76 h，加厚的分支菌絲呈珊瑚狀結構，主要沿著氣孔進行發育[25]。Pritsch 等在同一時間間隔（48～76 h）取樣的穎片中，用掃描電鏡在角質層下觀察到類似的加厚菌絲，同時可以看見在穎片表面分生孢子梗發育中的大分生孢子，表明禾谷鐮刀菌在這些組織上很快完成了一個無性循環[25]。

DON 是真核生物蛋白質合成的抑制劑，也是植物重要的毒力因子，它的產生使得鐮刀菌能夠從受感染的小花傳播到小麥穗軸[26]。Tri5基因是DON 毒素生物合成所必需的，是DON 生物合成第一步的關鍵酶，在感染的早期階段，它在侵染墊中表達[22]。有研究表明，Tri5缺失突變體限制了鐮刀菌對相鄰小花的感染[18]，使得癥狀僅發生在接種的小穗處。這表明DON 在最初的侵染過程中不是必需的，但對病原菌在穗部的擴展卻非常重要。

鐮刀菌毒素DON 同時會誘導小麥產生過氧化氫（H2O2）、細胞程序性死亡和防御反應[27]。在鐮刀菌侵染小麥時，活性氧（reactive oxygen species，ROS）可以使得細胞程序性死亡，利于鐮刀菌在死體營養階段的繁殖，同時會使小麥的防御反應啟動。DON 在毒素體結構中合成，然而，關于毒素體形成的機理和毒素體的成分尚未完全揭示。Tang 等研究確定了毒素體2 個新的組分，即肌動蛋白戴帽蛋白（CAPs）FgCapA 和FgCapB，這2 個CAPs 在禾谷鐮刀菌中形成異源二聚體，并且能夠與FgMyo1和Tri1互作，肌動蛋白CAPs 與毒素體的形成有關，對禾谷鐮刀菌的生長發育和毒力起關鍵作用[28]。

3 小麥赤霉病的抗性基因

3.1 小麥赤霉病抗性數量性狀基因座/基因定位

大量研究證明，小麥赤霉病的抗性是數量性狀，由多基因控制[10]。目前，研究者們已通過連鎖作圖和關聯作圖檢測到432 個數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL），分布在小麥的所有染色體上[1]。Ma等根據現有的標記信息確定，除了24 個QTL 不能定位到特定染色體區域、10 個定位到外源染色體外，其余的QTL 定位到了44 個染色體區域，但大多數QTL 仍需要驗證[1]。隨著抗源鑒定規模不斷擴大，且小麥赤霉病的抗性遺傳結構較復雜，更多抗性QTL 有待被發現，許多基因都可以賦予小麥赤霉病抗性，但可能作用較小。

目前在所有小麥染色體上均有赤霉病抗性QTL被定位，已命名的小麥抗赤霉病的基因只有7 個，即Fhb1—Fhb7（表2）。除報道的已克隆的基因Fhb1和Fhb7外，其他基因已被定位在染色體上。小麥基因組的完善、蛋白組學和代謝組學及生物信息學的發展和應用，為鑒定候選基因和克隆基因提供了機遇。

表2 文獻正式命名的小麥抗赤霉病基因

3.2 小麥赤霉病抗性基因克隆和分子機制

位于小麥3B 染色體短臂的Fhb1一直是國內外公認抗性最穩定、效應最大的主效QTL，在蘇麥3 號、望水白、寧7840 等抗源品種中廣泛存在，在育種上也得到一定的應用[10]。已報道的Fhb1候選基因有2個。首先是Rawat 等在2016 年報道了Fhb1基因克隆的結果，通過突變分析、基因沉默和轉基因過表達試驗，認為Fhb1區域的PFT（pore-forming toxin-like）基因具有赤霉病抗性，可能是Fhb1基因的候選基因[29]。PFT基因編碼1 種具有2 個凝集素結構域和1個ETX/MTX2（產氣莢膜梭菌ε毒素/球形芽孢桿菌滅蚊毒素）毒素結構域的嵌合凝集素。植物凝集素是一組不同來源的異質蛋白質，可與碳水化合物可逆結合，在植物防御昆蟲、線蟲、細菌、真菌和病毒中發揮作用，且ETX/MTX2 蛋白被證明是強有力的細菌毒素，在宿主的細胞膜上形成通道，導致其死亡。對PFT 蛋白三級結構的模擬表明，它可能參與真菌特異性碳水化合物的識別，并對真菌產生毒性。Rewat等采用定向誘導基因組局部突變技術（Targeting Induced Local Lesions In Genomes，TILLING）、RNAi誘導的基因沉默技術和轉基因技術驗證PFT功能，認為小麥中的一種蛋白質（Hfr2）與PFT 蛋白相似，這種蛋白可增加寄主的膜通透性，如果預測的PFT蛋白與抗真菌凝集素和ETX/MTX2 蛋白具有相似的功能，則PFT可能通過與真菌壁相互作用來阻止真菌生長[29]。

2019 年，分別有2 個團隊同時報道了Fhb1的另一個候選基因HRC/His。Su 等證明了一個編碼組氨酸鈣結合蛋白（Histidine-rich calcium-binding protein）的TaHRC是Fhb1介導的對小麥赤霉病抗性的關鍵決定因素[30]。該研究通過在近等基因系和重組自交系中進行驗證，認為HRC為Fhb1的候選基因并繼續研究其功能。該研究在序列比對中發現，TaHRC-R與TaHRC-S相比，TaHRC-R在相應的第二內含子和第三外顯子處有較大的缺失，去除了保守的剪接受體位點（AG）、翻譯起始密碼子（ATG）和ORF 中額外的22 bp 下游序列，并使用RNAi、CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced palindromic repeats-CRISPR-associated proteins system，常間回文重復序列叢集- 常間回文重復序列叢集關聯蛋白）敲除、單倍型分析、關聯分析、亞細胞定位等方法驗證其功能，認為Fhb1是一個感病基因，TaHRC基因編碼一種賦予赤霉病感病性的核蛋白，部分序列的缺失導致小麥易感性降低，間接提高了抗病性。對該基因的進化和單倍型的分析進一步表明，TaHRC-R等位基因具有單一起源，最有可能起源于攜帶大紅袍單倍型的品系。與此同時，Li 等也認為His（TaHRC）即為Fhb1[31]。2 個團隊的研究都對導致Fhb1抗性的候選基因達成一致，但他們對致病等位基因的結論卻截然不同。Li 等認為His基因中的部分序列缺失產生了新的基因變體，這個新等位變異是功能獲得性突變，造成了小麥對赤霉病的抗性，將His序列轉化到小麥和擬南芥中進行功能驗證，表現出了對禾谷鐮刀菌抗性增強[31]。研究表明，該基因的同源基因在植物中的翻譯產物具有很好的保守性，可能是植物生長發育所必需的[31]。這2 個團隊在對Fhb1的抗性候選基因上達成了一致，但對于其致病等位基因的結論不同，也都沒有對其機制進行解析。有專家評論認為，可能是由基因的顯性負效應（dominant-negative effect）引起，或者可能與Pm21類似，由基因簇共同起作用[39]。

第2 個被克隆的小麥赤霉病抗性基因是Fhb7。2020 年Wang 等成功克隆了來源于長穗偃麥草的抗赤霉病主效基因Fhb7，揭示了其抗病分子機理和遺傳機理，并成功應用于小麥[38]。該團隊首先進行了小麥近源物種長穗偃麥草的基因組組裝，基于組裝的參考基因組信息和之前研究的結果進行了抗赤霉病主效基因Fhb7的精細定位。通過構建抗病親本的物理圖譜獲得了候選基因，使用表達特征、突變體驗證、VIGS 基因沉默和轉基因實驗驗證功能后確定其就是Fhb7。Fhb7是一種谷胱甘肽轉移酶（gluthanione S-transferase，GST），GST 可以打開DON毒素的環氧基團，并催化其形成谷胱甘肽化合物，產生解毒效應，從而賦予小麥對赤霉病的抗性。該團隊認為Fhb7是由內生真菌基因水平轉移獲得，Fhb7對單端孢霉烯家族具有解毒的功能，并在不同的抗病與感病材料中進行了葉片、穎殼及穗部的抗性比較，驗證了Fhb7的功能。研究發現，Fhb7具有廣譜抗性，包括鐮刀菌種屬禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌以及小麥莖基腐病害。該團隊在育種利用方面，創制了小麥- 長穗偃麥草抗赤霉病的易位系，該易位系農藝性狀優良，后創制出更短片段的易位系，并應用于后續育種工作。

4 小麥-赤霉病菌互作的分子機制

過去幾年，在禾谷鐮刀菌中發現了許多與鐮刀菌侵染小麥過程有關的重要基因，包括一些效應因子基因，但鑒定出的禾谷鐮孢菌分泌產生的、直接作用于寄主植物細胞并導致病害發生的毒力分子仍然很少。其中FGL1編碼一種分泌型脂肪酶，在侵染小麥穗部的過程中，可以釋放游離脂肪酸來抑制與先天免疫相關的胼胝質的形成，突變的FGL1鐮刀菌菌株對小麥和玉米的致病力降低[40]。此外，FgNahG編碼一種分泌型水楊酸羥化酶，可以將水楊酸轉化為鄰苯二酚。FgNahG缺失突變體菌株的毒力降低，重新將FgNahG導入缺失突變體菌株導致該菌株恢復了野生型的表型[41]。2019 年Jia 等鑒定出了一種非核糖體八肽，認為它是禾谷鐮刀菌侵染小麥芽鞘所必需的毒力因子[42]。該研究發現，植物病原真菌禾谷鐮刀菌在侵染小麥期間，特異誘導次生代謝基因簇fg3_54 表達，合成一個以前未知的線性非核糖體八肽- 鐮孢菌素A（fusaoctaxin A），賦予鐮刀菌菌絲在小麥組織內從一個細胞穿壁入侵到旁鄰細胞并擴展的能力[42]。

Jiang 等的研究從另一個角度揭示了小麥與赤霉病菌間的互作分子機制[43]。該研究從50 個禾谷鐮刀菌孤兒分泌蛋白（orphan secreted protein，OSP）中發現了一個重要毒力因子Osp24；盡管Osp24 對禾谷鐮刀菌的生長和初始穿透力是沒有影響的，但它在禾谷鐮刀菌侵染小麥穗軸組織的過程中起著至關重要的作用；Osp24 在小麥赤霉病發病過程中特異性表達，其短暫表達可抑制細胞死亡；經試驗驗證，Osp24 被轉運到植物細胞中，其中8 個半胱氨酸基團中的2 個是其功能所必需的。試驗篩選到小麥SNF1（Sucrose non fermenting1，蔗糖非發酵相關蛋白1）激酶TaSnRK1α 和Osp24 互作，并證明在TaSnRK1α過表達或沉默的轉基因植物中，Osp24 對小麥赤霉病抗性有著重要的作用。Osp24 通過促進TaSnRK1α與泛素-26S 蛋白酶體的關聯，加速TaSnRK1α的降解。實驗同時證明，TaSnRK1α還與TaFROG互作，其中TaFROG是一種由DON 誘導的小麥孤兒蛋白。在機制解析中，TaFROG與Osp24 競爭與TaSnRKα在同一區域結合，如果TaFROG與TaSnRKα結合，則保護了TaSnRKα不被降解。TaFROG的過表達穩定了TaSnRK1α，并增加了小麥赤霉病抗性。綜上所述，Osp24 通過與TaFROG競爭結合TaSnRK1α而發揮細胞質效應蛋白的功能，證明了宿主和病原真菌的孤兒蛋白在相互作用過程中的反作用。

Wang 等克隆了長穗偃麥草中的抗赤霉病基因Fhb7。該團隊通過基因克隆、寄主基因組測序及比對發現，二倍體長穗偃麥草早期可能與（香柱真菌屬） 形成共生體，通過基因水平轉移將中Fhb7的DNA 整合到長穗偃麥草基因組中，從而進化出抗鐮刀菌屬病原菌侵染的功能。該發現首次提供了真核生物間核基因組DNA 水平轉移的功能性證據[38]。盡管上述研究對小麥和赤霉病菌的互作進行了解析，但小麥和真菌互作之間的復雜性仍需進一步探索。

5 展望

小麥是異源六倍體，本身基因組龐大且復雜，同時小麥赤霉病的抗性是數量性狀，由多基因控制，且環境因素影響巨大，小麥與真菌互作同樣具有復雜性，這些因素造成了研究者對小麥抗赤霉病機制的了解還十分有限。現在田間生產上小麥赤霉病的防治以化控為主，但實踐表明，化學防治會使赤霉病菌產生抗藥性。此外，也有關于小麥赤霉病菌拮抗菌株的研究[44]，盡管生物防治是更為環保的一種方法，但現在生物防治還未應用于生產。因此，選育抗赤霉病的品種仍是最綠色環保且有效的抗赤霉病措施。目前的栽培小麥只有極少數品種對赤霉病的抗性為高抗，研究小麥和赤霉病菌的互作機制顯得尤為重要。盡管小麥抗赤霉病基因的研究在近年來有所突破，但其機制有待進一步研究，未來小麥和赤霉病菌互作的研究將是工作的重點。

小麥中命名的抗赤霉病基因只有7 個，近年來小麥抗赤霉病基因Fhb1和Fhb7的相繼克隆，給小麥赤霉病育種家們提供了很好的參考，但小麥赤霉病的抗性機制及赤霉病菌與小麥互作等問題仍需進一步探討。Jiang 等通過在禾谷鐮刀菌中尋找孤兒蛋白Osp24，以與小麥SNF1 相關激酶TaSnRK1α互作來探究小麥和赤霉病菌之間的關系，在機制研究上為研究者提供了新的互作關鍵途徑和研究思路[43]。Fhb1候選基因已經克隆，也進行了相應的功能驗證，但抗病機制仍需進一步研究。來自于長穗偃麥草的抗赤霉病基因Fhb7是通過基因水平轉移的天然“轉基因”方式進入宿主，同樣給學者提供了新的思路來研究小麥與真菌之間復雜的互作關系。研究小麥- 赤霉病菌的互作在小麥抗赤霉病育種工作中至關重要，通過在育種工作中應用該互作機制中的相關基因和蛋白，有利于培育出對赤霉病具有穩定抗性且豐產高質的小麥品種。