青稞種質資源籽粒賴氨酸含量的評價

劉美池，鄧 歆，劉新春，楊可涵，倪子涵，何 雪，馬孝玲，馮宗云*

（1.四川農業大學西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室/農學院大麥青稞等健康功能作物研究中心，四川 溫江 611130；2.四川省農業科學院作物研究所，四川 成都 610066）

青稞（Hordeum vulgare L.var.nudumHook.f.）是普通栽培大麥種（Hordeum vulgareL.）的裸大麥變種[1]，栽培于大麥生態區劃中的裸大麥區，主要分布在我國的西藏、青海全境，四川的甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州及涼山彝族自治州（木里藏族自治縣），云南的迪慶藏族自治州，甘肅的甘南藏族自治州等青藏高原地區[1-3]。青稞是藏區重要的特色農作物，籽粒富含重要的營養功能成分[4-7]，具有“三高（高蛋白、高可溶性纖維、高維生素）兩低（低脂肪、低糖）”的營養特征，是藏族人民的重要食糧，被廣泛應用于各種速食品、釀酒和保健食品的開發[6]。賴氨酸是人體必需的氨基酸之一，它能夠促進人體的發育，增強免疫力并有提高中樞神經功能的作用。賴氨酸為堿性必需氨基酸，由于谷物中的賴氨酸含量低，并且在加工過程中容易被破壞而缺乏，故被稱為第一限制性的氨基酸。

青稞籽粒中的賴氨酸含量是評價青稞營養品質的重要指標，已受到青稞育種家的廣泛關注。研究青稞籽粒中賴氨酸的含量水平，對了解青稞種質資源賴氨酸含量的變異，評價和篩選出高賴氨酸含量的材料，選育高賴氨酸含量的新品種及提升青稞營養品質均具有重要的意義。

據報道，大麥籽粒的賴氨酸含量高于其他谷類作物[8-9]。國外于20 世紀70 年代在篩選和選育高賴氨酸大麥上就已取得較大成就[10]。張麗華等分析了全國5 977 份大麥樣品籽粒的賴氨酸含量（質量分數，下同），變異幅度在0.30%～0.75%，平均含量為0.47%，變異系數13.1%，篩選出含量在0.58%以上的高賴氨酸材料66 份[9]。張麗華等研究發現，賴氨酸含量在0.30%～0.39%的材料數占18.9%，0.40%～0.49%的占66.1%，0.50%～0.57%的占13.9%，0.58%～0.75%的占1.1%，春大麥區最高，高緯度地區大麥籽粒賴氨酸含量高于低緯度地區，呈現出區域性分布[11]。陳麗娟等分析了25 份皮大麥籽粒賴氨酸含量，平均為0.45%[12]。馬得泉等分析了2 008 份西藏野生大麥籽粒賴氨酸含量，變幅在0.33%～0.74%，平均為0.47%；大部分材料在0.40%～0.59%，占84.5%，而0.60%～0.74%僅占5.4%；西藏栽培大麥僅2 份材料籽粒賴氨酸含量高于0.60%[13-14]。黃志仁等在1997—1999 年3 年中測定了27 個大麥品種的賴氨酸含量，表明年份間有一定的變化，但各年中品種間的高低順序一致[15]；他們后續又測定了8 個皮大麥品種籽粒賴氨酸含量，變幅在0.261 0%～0.663 8%，品種間差異達極顯著水平[16]。范士靖等分析了14 個大麥品種籽粒賴氨酸含量，變幅為0.47%～0.62%[17]。張環等分析了95 份大麥籽粒賴氨酸含量，變幅為0.422%～0.616%[18]。但有關青稞（裸大麥）籽粒賴氨酸含量的報道并不多見[9,11,14,16,19-27]。張麗華等研究表明，裸大麥的賴氨酸含量平均高于皮大麥，一般在0.31%～0.60%[9,11]。陳麗娟等分析了103 份裸大麥籽粒賴氨酸含量，平均為4.7 g/kg[12]。黃志仁等分析了6 份裸大麥籽粒賴氨酸含量，發現品種間差異極顯著，含量在0.322 1%～0.536 7%[16]。姚豪穎葉等分析認為，13 份青稞材料賴氨酸含量在0.188%～0.437%[20]。

賴氨酸主要存在于動物性食物和豆類中，谷類食物中賴氨酸含量很低，賴氨酸在促進人體生長發育、增強機體免疫力、抗病毒、促進脂肪氧化、緩解焦慮情緒等方面都具有積極的營養學意義，同時也能促進某些營養素的吸收，能與一些營養素協同，更好地發揮各種營養素的生理功能。因此，本文對來自我國青藏高原的166 份青稞品種（系）進行籽粒賴氨酸含量測定，分析不同地區籽粒賴氨酸含量的變異，篩選出高賴氨酸含量青稞材料，并進行聚類分析，通過評價青稞種質資源賴氨酸含量的變異程度，篩選高賴氨酸含量的種質資源，提出新的賴氨酸含量分級標準，以期為選育出高賴氨酸含量的青稞新品種、提升青稞營養品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

166 份供試青稞材料來自我國青藏高原的不同地區，其中西藏86 份、四川28 份、青海44 份、甘肅8 份（表1）。所有材料均保存在四川農業大學國家大麥青稞產業技術體系成都綜合試驗站。

表1 供試青稞材料的編號、名稱及其來源

1.2 田間種植

2019 年10 月28 日將所有材料播種于成都市羊馬街道福田村國家大麥青稞產業技術體系成都綜合試驗站試驗基地（103°70′E、30°66′N），行長2.0 m，行距0.25 m，株距0.05 m，隨機區組試驗設計，3 次重復。田間管理同大田。籽粒成熟時去掉邊株，取中間植株混收脫粒曬干后于-4 ℃下保存備用。

1.3 賴氨酸含量的測定

1.3.1 標準曲線的制作。取7 只潔凈帶塞試管，編號后分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 50 μg/mL 亮氨酸標準液，然后依次加入2.0、1.9、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL 蒸餾水，混勻后再向每支試管內加入2.0 mL 4%碳酸鈉溶液和0.02 g/mL 茚三酮試劑[18]2.0 mL，搖勻，并于80 ℃保溫30 min后，用冷水冷卻試管至室溫；再向每支試管內加入95%乙醇4.0 mL，混勻后于530 nm 處測吸光度A，以所得吸光度為縱坐標，亮氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 試驗樣品處理。將青稞籽粒粉碎，將過80～100 目篩的細粉放入廣口瓶中，加入適量60～90 ℃的石油醚至淹沒粉面，浸泡8 h 進行脫脂。過濾后，用石油醚淋洗沉淀若干次，棄去濾液。將脫脂的青稞粉末晾在干凈的濾紙上，待石油醚吹干。收集干粉，置于干燥器內，保存備用。

1.3.3 樣品的測定。取15 mg 經處理后得到的青稞粉末于具塞干燥試管內，加2%碳酸鈉1.0 mL，置于80 ℃水浴中提取20 min，然后加茚三酮試劑2.0 mL 進行30 min 的保溫顯色，冷卻后加60%乙醇3.0 mL，混勻后過濾得濾液，在530 nm 波長下比色。

1.3.4 賴氨酸含量計算。賴氨酸含量的計算公式如下：

樣品中賴氨酸的含量（%）=[（從標準曲線上查得值，μg/mg）×10-3/（樣品質量，mg）]×q×100%-C。式中：q為校正系數，q=1.151 5；C為樣品中游離氨基酸含量（%）。

1.4 數據處理

將所得籽粒賴氨酸的數據，利用SAS2020 進行相關統計分析[19]。采用Excel 2019 進行數據初步分析，用SPSS28.0 統計軟件，對參試青稞材料籽粒賴氨酸含量進行系統聚類分析[20]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

用紫外分光光度計在530 nm 波長下測定溶液的吸光度，結果見圖1。由圖可知，在530 nm 可見光波長下的吸光度呈現良好的線性關系：y=0.016x+0.035 9，決定系數R2=0.993 5。表明用此方法測得的青稞籽粒賴氨酸含量試驗準確性高。

圖1 賴氨酸含量的標準曲線

2.2 不同青稞材料籽粒賴氨酸含量的分布

從圖2 中可以看出，青稞材料的賴氨酸含量在0.300%～0.550%分布最多，約占總青稞材料的85.0%。表明供試的青稞材料籽粒賴氨酸含量變異較大，呈正態分布。

圖2 青稞籽粒賴氨酸含量的頻率分布

由表2 可知，供試的青稞材料籽粒賴氨酸含量差異具有高度統計學意義（P＜0.01）。

表2 不同青稞材料籽粒賴氨酸含量的方差分析

2.3 不同來源地青稞材料間賴氨酸含量的差異

在166 份青稞材料中，對4 個不同地區間青稞籽粒賴氨酸含量進行方差分析，結果見表3。除了四川與甘肅的差異具有高度統計學意義（P＜0.01）外，其他省份（自治區）間差異均無統計學意義。表明四川與甘肅地區青稞籽粒賴氨酸含量差異大。

表3 不同地區青稞籽粒賴氨酸含量之差異

通過對不同地區青稞品種賴氨酸含量進行統計，比較4 個不同地區166 份材料（表4）。不同地區青稞材料的賴氨酸含量均值變化趨勢為四川＞西藏＞青海＞甘肅，賴氨酸含量的總平均值是0.446%，總變異系數為20.88%，其中西藏的變異系數最高，為20.63%，小于總體變異系數。賴氨酸含量最小值是0.275%（白青稞）。從賴氨酸含量變化幅度來看，不同來源地青稞材料的賴氨酸含量變異性相似。因此，青稞大麥品種資源籽粒中的賴氨酸含量受品種遺傳性狀及產地地理位置、氣象條件及栽培措施等因素的綜合影響。

表4 青稞材料籽粒賴氨酸含量的表型分布

2.4 青稞籽粒賴氨酸含量的聚類分析

對供試材料賴氨酸含量數據處理之后，進行系統聚類分析，結果如圖3，將166 份青稞籽粒品種聚類為4 大類群，遺傳距離定為0.126 處（表5）。第Ⅰ類群包括1 份賴氨酸含量高的青稞品種（系），來自西藏朗縣（長芒白青稞），其賴氨酸含量為0.834%。第Ⅱ類群包括6 份賴氨酸含量較高的青稞品種（系），賴氨酸平均含量為0.688%，變幅為0.649%～0.744%，其中西藏2 份、四川1 份、青海3 份，這類群供試材料變異系數為4.92%，主要來自青海地區。第Ⅲ類群包括58 份賴氨酸含量較低的青稞品種（系），賴氨酸平均含量為0.353%，變幅為0.275%～0.403%，其中西藏29 份、四川5 份、青海19 份、甘肅5 份，這類供試材料變異系數為10.66%，主要來自西藏地區，占50%。第Ⅳ類群包括101 份賴氨酸含量低的青稞品種（系），賴氨酸平均含量為0.479，變幅為0.407%～0.611%，其中西藏54 份、四川22 份、青海22 份、甘肅3 份，這類供試材料變異系數為10.67%，主要來自西藏地區，占53%（表6）。所有供試材料籽粒賴氨酸含量的平均值為0.446%，變異幅度為0.275%～0.834%，其中：來自西藏朗縣的長芒白青稞（編號：35）含量最大，為0.834%；西藏八宿的白青稞（編號：13）含量最小，為0.275%；青稞籽粒賴氨酸含量最大值達最小值3 倍以上。據此選出長芒白青稞、昆侖10 號、白六棱、米如紅、紫青稞等9 種青稞籽粒賴氨酸含量＞0.6%的品種和10 種青稞籽粒賴氨酸含量＜0.6%的較低品種（表7）。

圖3 166 份青稞材料賴氨酸含量的聚類分析

表5 聚類分析四大類青稞籽粒賴氨酸含量的表型分布

表6 不同地區青稞材料在各類群中的數量

表7 含量較高和較低賴氨酸種質材料

通過聚類分析，依據賴氨酸含量將166 份青稞材料劃分成四大類，根據不同類青稞品種賴氨酸含量進行方差分析，比較不同類的166 份材料（表8）。第Ⅰ類群、第Ⅱ類群與第Ⅲ類群、第Ⅳ類群差異有高度統計學意義（P＜0.01）；第Ⅲ類群與第Ⅳ類群差異也有高度統計學意義（P＜0.01）。

表8 不同聚類類別青稞籽粒賴氨酸含量差異

3 討論與結論

程曉彬等分析了康青3 號、康青5 號、康青6號、康青7 號、康青8 號、康青9 號、康青10 號共7 個品種籽粒賴氨酸含量，其含量均較低[14]。原紅軍等分析表明，西藏青稞賴氨酸含量在0.31%～0.79%，變異系數為6.37%[21]。劉婷婷等對青稞氨基酸進行了測定與評價，賴氨酸含量平均為0.367%，評分高于小麥、粳米、玉米和小米[23]。Huang 等分析了來自西藏不同縣的245 份材料籽粒賴氨酸含量，平均為0.39%[27]。侯殿志等研究了29 種西藏青稞品種籽粒賴氨酸含量的變異，含量在0.32%～0.43%[22]。報道還顯示，青稞氨基酸含量地方品種高于育成品種[24]。而在本研究166 份青稞供試材料中，賴氨酸的質量分數最大值為0.834%，最小值為0.275%，平均值為0.446%，高于上述研究。有研究認為，青稞籽粒賴氨酸含量受環境生態氣候因子影響，最優關鍵高原生態氣候因子是日平均氣溫≥0 ℃、積溫≥10 ℃積溫和年降雨量[25]，主要環境因素是土壤全氮含量、年均日照時數、年均降雨量、年均相對濕度和8 月平均降雨量[26]，所以本研究中賴氨酸平均含量較高的影響因素可能是環境和遺傳因素。

依據籽粒賴氨酸含量進行聚類分析，將青稞品種劃分為4 類：第Ⅰ類賴氨酸含量0.834%，為賴氨酸含量最高的青稞品種；第Ⅱ類賴氨酸含量較高，在0.649%～0.744%，賴氨酸青稞品種占樣品總數3.61%；第Ⅲ類賴氨酸較低，含量在0.275%～0.403%，占供試樣品總數34.94%；第Ⅳ類賴氨酸含量在0.407%～0.611%，占樣品總數60.84%。對不同地區青稞籽粒賴氨酸含量進行方差分析，得出四川與甘肅地區的差異具有高度統計學意義（P＜0.01）；將供試材料進行聚類分析分成4 大類群，方差分析得出第Ⅰ、Ⅱ類群與第Ⅲ、Ⅳ類群差異具有高度統計學意義（P＜0.01）；第Ⅲ類群與第Ⅳ類群差異也有高度統計學意義（P＜0.01）。說明以上分類可靠。

來自西藏的青稞供試材料為86 份，賴氨酸含量在0.407%～0.834%，該地區青稞材料賴氨酸含量普遍較高的共有57 份，占66.28%，這可能與當地氣候條件有關，該現象表明西藏地區可能有進行賴氨酸功能性研究的良好材料，同時能夠為賴氨酸的基礎性研究提供理論依據。馬得泉等參照國外有關標準和國內小麥標準，認為大麥籽粒賴氨酸含量≥0.5%為高賴氨酸優質資源[13]。按照相關標準，本次供試材料166 份中，大麥籽粒賴氨酸含量≥0.5%的共有40 份（表9），按聚類分析，其中第Ⅰ、Ⅱ類賴氨酸含量為0.649%～0.834%，共有7 個品種，分別是長芒白青稞、白六棱、紫青稞、昆侖10 號、青稞、米如紅、昆侖3 號細選。

表9 40 份青稞種質賴氨酸含量（質量分數）

通過聚類分析，不僅為劃分不同品種的青稞籽粒賴氨酸含量提供參考，并且本研究篩選出的高賴氨酸材料為青稞品種選育及栽培提供了有利依據。