二草清肝湯含藥血清對人源HL-7702肝細胞凋亡的影響及其機制研究*

黃健瑩 歐陽欽 吳春明 劉三海 王麗佳 趙安靜 謝遠太

浙江中醫藥大學附屬溫州市中醫院 浙江 溫州 325000

浙南名老中醫任俠民先生以溫州道地藥材雞骨草和垂盆草，創立二草清肝湯（EQD），臨床和基礎研究證實對急性肝衰竭（ALF）有一定的療效[1]。前期實驗顯示二草清肝湯（EQD）對免疫性肝損害大鼠的肝細胞凋亡具有保護作用，其機制與肝細胞內的PI3K/AKT/GSK3β 信號途徑的活化受抑制有關[2]；最新研究顯示ALF 小鼠肝組織Tott 樣受體4（TLR4）mRNA 表達明顯升高，EQD 能下調肝組織的TLR4 mRNA 表達[3]。據此，我們推測EQD 可能是通過肝細胞TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路調控肝細胞凋亡。因此，本研究擬以脂多糖（LPS）構建人源HL-7702 肝細胞凋亡模型，在分子和細胞水平檢測相關凋亡信號分子表達情況，為EQD 用于防治ALF 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞：BALB/C，雄性，周齡6～8w，30只，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；飼養環境：溫度20～26℃，濕度40%～70%。人源HL-7702 肝細胞（貨號：CL-0190），購自普諾賽生物公司。

1.2 實驗藥物：所用中藥材均購自溫州永安堂中藥飲片公司，按原方比例（雞骨草、垂盆草、茵陳各15g，制大黃3g，茯苓、澤瀉、蒼術各10g，陳皮、甘草各6g），水煎2次合并藥液，過濾濃縮至含生藥3.3g/mL，加入其兩倍的乙醇拌勻，沉淀后取得上清液；回收乙醇后濃縮得浸膏，加入糊精、蔗糖混勻，制粒即得。實驗前取蒸餾水溶解，按1∶2∶3 比例分別制成二草清肝湯小劑量、中劑量和大劑量，以備實驗時用。

1.3 試劑：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（批號：AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯科生物）；GSK3β（批號：22104-1-AP，protein tech）；Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG（批號：As007，ABclonal）；即用型DAPI 染液（批號：KGA215-50，凱基）；CCK-8 法細胞增殖檢測試劑盒（批號：KGA317，凱基生物）；Trizon Reagent（批號：CW0580S，CWBIO）；超純RNA 提取試劑盒（批號：CW0581M，CWBIO）；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）（批號：R223-01，Vazyme）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批號：Q711-02，Vazyme）；50×TAE 緩沖液（批號：T1060，Solarbio）；6×DNA Loading Buffer（批號：GH101-01，TRANS）；50bp DNA Ladder（批號：MD108，TIANGEN）；Gsafe Red plus 核酸染料（批號：GK20002，GLPBIO）；瓊脂糖粉（批號：75510-019，Invitrogen）；LPS（批號：L2880，Sigma）。

1.4 儀器：旋渦混合器（XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；低溫高速離心機（TGL-16D，常州中捷實驗儀器制造有限公司）；流式細胞儀[Novo Cyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]；熱恒溫培養箱（DHP-9054，山東博科生物）；電熱恒溫鼓風干燥箱（HGZF-101-1，上海躍進醫療器械有限公司）；熒光顯微鏡（CKX53，OLYMPUS）；高壓鍋（YS20ED，蘇泊爾）；全自動樣品快速研磨儀（Tiss-12，上海凈信實業發展有限公司）；高速臺式冷凍離心機（H1750R，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；微型離心機（D1008E，SCJLOGEX）；旋渦混合器（XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；紫外分光光度儀（NP80，Nano Photometer）；電泳儀（DYY-8C，北京六一生物科技有限公司）；普通PCR 擴增儀（TC-EA，杭州博日科技有限公司）；熒光PCR儀[CFX Connect實時，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]；超高靈敏度化學發光成像系統儀[ChemiDocTM XRS+，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司]。

1.5 實驗方法：分述如下。

1.5.1 小鼠急性肝衰竭模型構建和含藥血清的制備：分組：空白對照組（n=6）、LPS 組（n=6）、LPS+EQD 低劑量組（n=6）、LPS+EQD 中劑量組（n=6）、LPS+EQD 高劑量組（n=6）；灌胃：制取二草清肝湯EQD，LPS+EQD 低劑量組為0.2mL/d，LPS+EQD 中劑量組為0.3mL/d，LPS+EQD 高劑量組為0.4mL/d，灌胃，1 日1 次，共12 天；正常組和LPS 組同時予3mL/kg·d 的生理鹽水灌胃，1 日1 次，共12 天。末次給藥4h 后，除空白對照組外所有小鼠均腹腔注射D-Gal（800mg/kg）和LPS（7.5mg/kg），制備ALF 小鼠模型。末次注射LPS 24h后，處死各組小鼠。取各組肝組織和血清進行后續實驗。

1.5.2 細胞處理：棄去細胞培養上清，用1×PBS 洗2遍，加入0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，待細胞變圓加入培養基終止消化并收集細胞懸液至10mL 離心管中，1000rpm 離心3min，棄去上清液加入培養基重懸細胞，計數，根據實驗需要對細胞鋪6孔板和96孔板，將細胞根據實驗需要進行稀釋，96 孔板每孔3000 和5000 個細胞，均勻地鋪到細胞培養板中，做好標記，放置培養箱中培養，待細胞完全貼壁后，按照分組，加入不同劑量的含藥血清100μL 預處理2h，然后再加入10μg/mL 的10μL LPS處理24h，空白對照組加入100μL+10μL的生理鹽水。

1.5.3 流式檢測凋亡：收集1～3×106個細胞，加1mL PBS，1500rpm 離心3min，洗兩遍；用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer；取300μL預冷的1×Binding Buffer 重懸細胞；每管各加入5μL Annexin V-FITC 和10μL PI；輕微混勻后，室溫避光孵育10min；再向每管中加入200μL 預冷的1×Binding Buffer；混勻后上流式儀檢測。

1.5.4 免疫熒光：細胞的固定：棄上清后PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定15min，PBS 浸洗培養皿3 次，每次3min。打孔：0.5%Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20min。PBS 浸洗培養皿3 次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養皿上滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗：移液槍吸掉封閉液，不洗，每個培養皿滴加足夠量的稀釋好的一抗；GSK3 bate（1∶200）4℃孵育過夜；PBS 浸洗培養皿3 次，每次3min，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37℃孵育30min，PBS 浸洗培養皿3 次，每次3min。注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。復染核：滴加DAPI 避光孵育5min，對標本進行染核，用PBS浸洗多余的DAPI；封片：用20%甘油封閉培養皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5.5 實時熒光定量PCR（qPCR）：采用Trizon 試劑提取總RNA，用UV-Vis 分光光度計測定RNA 濃度和純度。然后，對提取的RNA 進行逆轉錄和熒光定量PCR 檢測。β-actin 作為內參，bax、bcl-2 和active-caspase3 的相對表達量根據2-△△Ct法計算。序列見表1。

表1 PCR引物序列、產物長度及退火溫度

1.5.6 Western blot 檢測：棄掉培養皿中的細胞培養液，每孔加入100μL 的細胞裂解液，置于冰上20 min。用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的EP管中。12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液移至新的EP 管（BCA 測定），總蛋白置于-20℃保存。根據BCA 試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性，上樣進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳（SDS-PAGE）1.5h，后用300mA 恒流轉膜1.5h。用PVDF膜孵育一抗，4℃過夜，次日PVDF膜室溫孵育二抗2h，洗膜，用發光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學發光成像系統樣品放置區運行程序顯影成像。

1.6 統計方法：應用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。所有實驗重復3次，定量結果采用均數±標準差（±s）表示。兩組之間定量數值比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間定量數值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EQD 對HL-7702 肝細胞凋亡影響：如圖1 所示，LPS、不同劑量EQD 分別處理人源HL-7702 肝細胞后，流式檢測各組細胞的凋亡情況，可以看出，與對照組相比，LPS 處理后，HL-7702 肝細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD 分別處理后，HL-7702 肝細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），且中、高劑量EQD 下降更顯著（P＜0.05）。說明EQD 可以顯著抑制LPS引起的HL-7702肝細胞凋亡。

圖1 流式檢測各組細胞凋亡率

2.2 EQD 對HL-7702 肝細胞中GSK3β 核易位的影響：如圖2所示，采用LPS及不同劑量EQD分別處理HL-7702肝細胞后，免疫熒光檢測各組細胞中GSK3β表達情況，可以看出，GSK3β 主要在HL-7702 的細胞質表達，細胞核有少量表達。且與對照組比較，LPS 處理后，HL-7702中GSK3β 表達顯著上升，且趨向于向細胞核中聚集（P＜0.05）。與LPS組相比，加入低、中、高EQD分別處理后，HL-7702 肝細胞中GSK3β 表達顯著下降，且中、高劑量下降更顯著，趨向于向細胞質中聚集（P＜0.05）。說明EQD 可以顯著抑制HL-7702 肝細胞中LPS 誘導后的GSK3β表達。

圖2 免疫熒光檢測GSK3β核異位情況

2.3 EQD對HL-7702肝細胞中凋亡相關基因Bax、Bcl-2和炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平的影響：如圖3所示，采用LPS 及不同劑量EQD 分別處理HL-7702 肝細胞后，qPCR 檢測各組細胞中Bax、Bcl-2 和TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平情況，與對照組比較，LPS 處理后，HL-7702肝細胞中的Bax、TNF-α、IL-6顯著上升，Bcl-2 表達顯著下降（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD分別處理后，HL-7702肝細胞中Bax、TNF-α、IL-6顯著下降，Bcl-2 表達顯著上升（P＜0.05）。說明EQD 可以抑制LPS引起的凋亡和炎癥反應。

圖3 qPCR檢測各組小鼠肝組織中凋亡相關基因Bax、Bcl-2 和炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達水平

2.4 EQD 對HL-7702 肝細胞中下游蛋白AKT、GSK3β 及其磷酸化表達水平的影響：如圖4 所示，LPS、不同劑量EQD 分別處理HL-7702 肝細胞后，Western-blot 檢測各組細胞的AKT、GSK3β及其磷酸化表達情況，可以看出，與對照組比較，LPS 處理后，AKT、GSK3β、p-AKT、p-GSK3β 表達顯著上升（P＜0.05）。與LPS 組比較，加入低、中、高EQD分別處理后，AKT、GSK3β表達顯著上升（P＜0.05），p-AKT、p-GSK3β 表達顯著下降（P＜0.05）。說明EQD可以顯著抑制HL-7702肝細胞中LPS誘導后的p-AKT、p-GSK3β表達。

圖4 Western blot檢測各組細胞中GSK3β、p-GSK3β、AKT、p-AKT蛋白表達水平

3 討論

急性肝功能衰竭（ALF）的最主要病理形態學特征是肝細胞壞死，而肝細胞壞死的基礎是肝細胞凋亡，大量肝細胞凋亡導致ALF 的發生[4]。筆者經前期實驗研究發現，人源HL-7702 細胞內有TLR4 介導PI3K/AKT/GSK3β 信號通路，并且TLR4 通過PI3K/AKT/GSK3β 通路介導了HL-7702 細胞凋亡的調控。目前尚未發現任何西藥可以有效地阻抑肝細胞凋亡的發生。基于肝細胞凋亡在ALF 中的作用，能否以TLR4 為靶點，通過其介導PI3K/AKT/GSK3β 信號通路來干預肝細胞凋亡的發生，從而為臨床治療ALF提供新的思路。臨床研究證實二草清肝湯EQD對治療ALF有較好療效。實驗發現，EQD能降低免疫性肝損害大鼠的血清TNF-α、IL-12 水平，抑制其肝細胞Bax的表達，促進Bcl-2的表達，對免疫性肝損害大鼠的肝細胞凋亡具有保護作用，其機制與肝細胞內的PI3K/AKT/GSK3β 信號途徑的活化受抑制有關[2]。

本次流式細胞儀檢測的結果表明EQD 可以顯著抑制LPS 引起的HL-7702 細胞凋亡。同時，免疫熒光檢測GSK3β 核易位的結果說明EQD 可以顯著抑制HL-7702細胞中LPS 誘導后的GSK3β 表達，而GSK3β 是TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通道中重要的下游分子。TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 通路是最重要的介導細胞凋亡的信號通路，能夠介導多種生物學效應，對細胞凋亡、存活起調節作用[5]。有研究表明，肝損傷和ALF時TLR4表達增加，TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 通路呈激活狀態，肝細胞凋亡率增加[6]。而本次Western-blot 實驗研究顯示，EQD可以顯著抑制HL-7702 細胞中LPS 誘導后的p-AKT、p-GSK3β 表達，提示加入EQD 后，TLR4/PI3K/AKT/GSK3β通路呈抑制狀態，小鼠HL-7702 細胞凋亡率下降，與流式細胞儀結果相一致。

Bcl-2 家族是TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路重要的下游底物，主要包括抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax；TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路激活的表現就是釋放大量的炎癥細胞因子，引起細胞凋亡，其中TNFα、IL-6是最典型的炎癥細胞因子[7，8]。而本次qPCR檢測結果顯示，EQD可以抑制LPS引起的凋亡和炎癥反應，對HL-7702肝細胞凋亡有干預作用。

實驗結果提示，EQD 預處理可以顯著降低由LPS 誘導的人源HL-7702 肝細胞凋亡率，這種作用可能是通過抑制TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信號通路中重要蛋白分子的表達，如TLR4、AKT、GSK3β、Bax、Bcl-2 等來實現的。有關EQD 的具體干預機制尚需進一步動物實驗進行研究證實。