不同非病毒載體對原代肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和毒性作用研究

金靜 楊纖纖 周友浪

[摘 ? 要] ? 目的：研究并比較非病毒載體納米球和脂質(zhì)體對原代肌腱細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以及毒性作用。方法：制備不同N/P比例的PLGA納米球，原代培養(yǎng)雞、大鼠、小鼠肌腱細(xì)胞，將低、中、高不同劑量的pEGFP-N1質(zhì)粒負(fù)載于納米球和脂質(zhì)體，對三種肌腱細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過熒光拍照和流式細(xì)胞分析，檢測質(zhì)粒在24、48、72、96 h的轉(zhuǎn)染效率，Western Blot法檢測GFP表達(dá)水平，CCK8法檢測轉(zhuǎn)染24、48、72 h細(xì)胞活力。結(jié)果：對于雞肌腱細(xì)胞，納米球的轉(zhuǎn)染效率顯著高于脂質(zhì)體，尤其是NP10的GFP表達(dá)最明顯，且對細(xì)胞無毒性作用。對于大鼠肌腱細(xì)胞，NP10的轉(zhuǎn)染效率最佳，其次是NP6和脂質(zhì)體，但脂質(zhì)體降低了細(xì)胞活性。對于小鼠肌腱細(xì)胞，納米球和脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率均較低，且隨著時(shí)間與劑量的增加，細(xì)胞毒性作用越來越明顯。結(jié)論：NP10是雞和大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的最佳試劑，但小鼠肌腱細(xì)胞最合適的轉(zhuǎn)染試劑還需進(jìn)一步探索。

[關(guān)鍵詞] ? 非病毒載體；納米球；脂質(zhì)體；質(zhì)粒；原代肌腱細(xì)胞

[中圖分類號] ? Q2-33 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.001

Study on the transfection efficiency

and toxicity of primary tendon cells by different non-viral vectors

JIN Jing1，2， YANG Qianqian1， ZHOU Youlang1

（1Clinical Medical Research Center， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001;

2School of Medicine， Nantong University）

[Abstract] ? Objective： To investigate and compare the transfection efficiency and toxicity of non-viral vector nanoparticles and liposomes on primary tendon cells. Methods： PLGA nanoparticles with different NP ratios were prepared， and the tendon cells of chicken， rat and mouse were cultured. The low， medium and high doses of pEGFP-N1 plasmid were loaded into nanoparticles and liposomes， and the three cells were transfected. The transfection efficiency of the plasmid at 24， 48， 72 and 96 hours was detected by fluorescence photography and flow cytometry. The expression level of GFP was detected by Western Blot， and cell activity was detected by CCK8 at 24， 48 and 72 hours after transfection. Results： For chicken tendon cells， the transfection efficiency of nanoparticles was significantly higher than that of liposomes， especially the GFP expression of NP10 was the most obvious， and it was not toxic to cells. For rat tendon cells， NP10 had the best transfection efficiency， followed by NP6 and liposomes， but liposomes reduced cell activity. For mouse tendon cells， the transfection efficiency of nanoparticles and liposomes was low， and the toxic effect on cells became more and more obvious with the increase of time and dose. Conclusion： NP10 is the best transfection reagent for plasmid transfection in chicken and rat tendon cells， but the most suitable transfection reagent for mouse tendon cells needs further exploration.

[Key words] ? non-viral vector; nanoparticle; liposome; plasmid; primary tendon cell

肌腱發(fā)生損傷后一般通過外源性愈合和內(nèi)源性愈合進(jìn)行組織修復(fù)，外源性愈合主要由腱鞘和滑膜的成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等侵入損傷部位，內(nèi)源性愈合是內(nèi)部成纖維細(xì)胞等直接作用于肌腱斷端。過多的外源性愈合通常會(huì)導(dǎo)致粘連形成，影響肌腱滑動(dòng)功能的恢復(fù)，因此，增強(qiáng)內(nèi)源性愈合是促進(jìn)肌腱愈合并減少粘連的重要途徑[1-2]。由于肌腱內(nèi)源性細(xì)胞稀少，近年來基因治療肌腱損傷逐漸受到關(guān)注。將生長因子基因轉(zhuǎn)入肌腱細(xì)胞中，可持續(xù)、高效翻譯出有利于肌腱細(xì)胞生長的生長因子，進(jìn)而促進(jìn)肌腱內(nèi)源性修復(fù)[3-5]。基因治療中載體主要包括病毒載體與非病毒載體，考慮到生物相容性和倫理問題，目前非病毒載體被廣泛研究，其中脂質(zhì)體是一種較為成熟的非病毒載體，已證實(shí)在多種細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)染效率[6]。

本課題組研發(fā)的非病毒載體PLGA納米球具有緩慢釋放和生物相容性高的優(yōu)勢，并在雞、大鼠的肌腱細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、siRNA等[7-9]。本文擬比較三種PLGA納米球（NP6，NP8，NP10）和脂質(zhì)體（Lipo）對三種常用動(dòng)物（雞、大鼠、小鼠）肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率以及毒性的影響，探索轉(zhuǎn)染質(zhì)粒效率最高、毒性最小的轉(zhuǎn)染試劑，以促進(jìn)基因治療在肌腱修復(fù)中的進(jìn)一步應(yīng)用與發(fā)展。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 轉(zhuǎn)染試劑及pEGFP-N1質(zhì)粒的制備 ? 通過復(fù)乳法獲得納米球，將200 mg 聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）溶解于2 mL二氯甲烷，然后將之緩慢滴加在6 mL的7%（w/v）聚乙烯醇（PVA）（Sigma-Aldrich，美國）溶液中，使用超聲儀（Bandelin electronic，德國）超聲處理60 s以產(chǎn)生初級乳液。將初級乳液添加到100 mL 1%（w/v）PVA溶液中，再次超聲處理180 s以形成雙乳液，在室溫下攪拌24 h揮發(fā)二氯甲烷。13 000 r/min離心5 min，分離PLGA納米顆粒，去離子水洗滌2次。按不同N/P比（聚乙烯亞胺基摩爾數(shù)/質(zhì)粒磷酸基摩爾數(shù)）得到NP6，NP8和NP10納米球。脂質(zhì)體（ThermoFisher LL3000015，美國）。pEGFP-N1載體由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建，其攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（GFP）基因可以檢測不同轉(zhuǎn)染試劑對肌腱細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2 ? 原代肌腱細(xì)胞培養(yǎng) ? 使用PBS緩沖液配制濃度為1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶（索萊寶科技有限公司，中國）溶液，過濾后存于4 ℃待用。動(dòng)物處死后，在超凈臺(tái)下用無菌器械取下肌腱組織，PBS清洗6次。組織剪碎后置于Ⅰ型膠原酶溶液中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2 h。細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min獲取細(xì)胞沉淀，以DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 ? 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ? 將肌腱細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞融合度為70%左右時(shí)，將低、中、高（1 μg/孔、2 μg/孔、3 μg/孔）三種劑量的N1質(zhì)粒分別負(fù)載于納米球（1 μL/孔、2 μL/孔、3 μL/孔），室溫孵育15 min后加入到細(xì)胞上清中，N1質(zhì)粒與脂質(zhì)體的結(jié)合按試劑說明書操作。所有孔均在轉(zhuǎn)染后24 h換液，并在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96 h進(jìn)行熒光拍照及轉(zhuǎn)染效率檢測。與24孔板轉(zhuǎn)染方法相同，將細(xì)胞接種于96孔板，根據(jù)孔徑底面積的大小，將低、中、高（0.2 μg/孔、0.4 μg/孔、0.6 μg/孔）三種劑量的N1質(zhì)粒通過納米球（0.2 μL/孔、0.4 μL/孔、0.6 μL/孔）和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞活性。

1.4 ? 轉(zhuǎn)染效率檢測 ? 細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后置于熒光顯微鏡下（Leica DMR 3000，德國）觀察并拍照（文中每種細(xì)胞僅展示納米球和Lipo轉(zhuǎn)染效率最高的熒光圖片），隨后用胰酶消化細(xì)胞，完培終止消化后，1 000 r/min離心5 min，PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀（Attune NxT，Invitrogen，美國）檢測GFP陽性信號，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對照。

1.5 ? Western Blot法 ? 采用RIPA裂解液在4 ℃下提取2 μg質(zhì)粒/孔劑量下的細(xì)胞蛋白，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。以抗兔GFP一抗（1 ∶ 1 000，CST，美國）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后，以熒光二抗（1 ∶ 10 000，Lincoln，美國）在室溫下孵育2 h，再次清洗膜后，采用奧德賽紅外成像系統(tǒng)（LI-COR，Lincoln，美國）掃描并顯示出條帶，用Image J軟件定量蛋白條帶的灰度值。

1.6 ? CCK8法測定細(xì)胞活力 ? 完培稀釋CCK8濃縮液（諾唯贊公司，中國）配制成1×CCK8溶液，棄細(xì)胞上清，每孔加入100 μL 1×CCK8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，美國）在450 nm激發(fā)光波長下讀取OD值。

1.7 ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ? 應(yīng)用GraphPad軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ? 結(jié) ? ? ?果

2.1 ? 雞肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性 ? 由表1可見，1 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，Lipo轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于NP6、NP8、NP10納米球，轉(zhuǎn)染72 h時(shí)1 μg質(zhì)粒Lipo轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于NP10納米球，轉(zhuǎn)染96 h時(shí)1 μg質(zhì)粒Lipo轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于NP10納米球，3 μg質(zhì)粒Lipo轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于NP6納米球。在其他時(shí)間和劑量下，NP6、NP8、NP10納米球?qū)﹄u肌腱細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于Lipo，納米球轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)39%左右，Lipo轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)30%左右。熒光圖顯示納米球轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白明顯多于Lipo組（圖1A），NP6、NP8、NP10和Lipo均能夠促進(jìn)GFP蛋白的表達(dá)，且NP10組GFP蛋白表達(dá)量最高（圖1B）。CCK8檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)中劑量NP6和高劑量NP8對肌腱細(xì)胞活力產(chǎn)生毒性作用（圖1C）。

2.2 ? 大鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性 ? 由表2可見，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，NP6、NP8、NP10納米球?qū)﹄u肌腱細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于Lipo。轉(zhuǎn)染48 h、72 h和96 h時(shí)，納米球僅在某些劑量下對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于Lipo。但Lipo的最高轉(zhuǎn)染效率僅約14%，而納米球轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到25%，因此，納米球組細(xì)胞綠色熒光顯著多于Lipo組（圖2A）。NP6、NP8、NP10和Lipo均能夠顯著促進(jìn)GFP蛋白表達(dá)，其中NP10組GFP蛋白表達(dá)量最高（圖2B）。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)Lipo組細(xì)胞活力較Control組明顯降低，表明Lipo對大鼠肌腱細(xì)胞有一定毒性作用（圖2C）。

2.3 ? 小鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性 ? 由表3可見，在相同轉(zhuǎn)染時(shí)間和相同劑量下，NP6、NP8、NP10納米球?qū)π∈蠹‰旒?xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高于Lipo，盡管部分轉(zhuǎn)染時(shí)間與劑量下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納米球和Lipo對小鼠的轉(zhuǎn)染效率均較低，納米球最高轉(zhuǎn)染效率約11%，Lipo最高轉(zhuǎn)染效率約3.5%，綠色熒光和GFP蛋白的升高均不明顯（圖3A、3B）。納米球和Lipo組細(xì)胞活力較Control組顯著降低，表明納米球和Lipo對小鼠肌腱細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性（圖3C）。

3 ? 討 ? ? ?論

由于肌腱內(nèi)部血供有限和細(xì)胞稀少，肌腱組織中內(nèi)源性生長因子匱乏，導(dǎo)致肌腱在發(fā)生損傷后愈合緩慢，常常面臨再次斷裂的風(fēng)險(xiǎn)。本課題組早期研究證實(shí)，通過腺相關(guān)病毒（AAV2）轉(zhuǎn)染堿性成纖維生長因子（bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）進(jìn)入肌腱組織，對肌腱細(xì)胞的生長和Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成產(chǎn)生重要作用，促進(jìn)損傷肌腱的愈合[4-5，10]。盡管病毒類載體具有良好的基因遞送效能，但制造過程復(fù)雜、成本昂貴，且存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

近年來，國際上推出陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，該技術(shù)適用宿主范圍廣，操作簡便，對細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高，其中聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳。在前期研究中我們將bFGF和VEGF質(zhì)粒負(fù)載于PEI修飾的PLGA納米球上（NP），成功轉(zhuǎn)染雞的肌腱細(xì)胞和肌腱組織，并取得肌腱愈合強(qiáng)度顯著增加的療效[7]。不僅如此，我們將siRNA負(fù)載于PEI修飾的PLGA納米球上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織后目的基因的表達(dá)均下調(diào)[11]。

為了進(jìn)一步推廣納米球的應(yīng)用，本研究系統(tǒng)比較非病毒載體PLGA納米球（NP6，NP8，NP10）和脂質(zhì)體（Lipo）對雞、大鼠、小鼠肌腱細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率及毒性。結(jié)果顯示，對于雞和大鼠肌腱細(xì)胞，NP10轉(zhuǎn)染N1質(zhì)粒的效率最高。有趣的是，在雞肌腱細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率隨著時(shí)間的增加而逐漸升高，而在大鼠肌腱細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率隨著時(shí)間的增加而降低，但都不存在明顯的劑量依賴性，NP10對細(xì)胞也無明顯的毒性作用。對于小鼠肌腱細(xì)胞，本研究未篩選出最合適的非病毒載體，無論是納米球還是Lipo，對小鼠肌腱細(xì)胞均有顯著的細(xì)胞毒性，盡管納米球組的細(xì)胞表達(dá)少量綠色熒光，但Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示GFP表達(dá)并未升高。

綜上所述，利用高比例的PEI修飾納米球NP10能將外源性基因有效轉(zhuǎn)染至雞和大鼠的肌腱細(xì)胞中，NP10作為非病毒載體后續(xù)可用于雞和大鼠肌腱損傷基因治療的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] BEREDJIKLIAN P K. Biologic aspects of flexor tendon laceration and repair［J］. J Bone Joint Surg Am，2003，85（3）：539-550.

[2] 陳鋼，張正治. 基因治療在肌腱愈合中的應(yīng)用［J］. 局解手術(shù)學(xué)雜志，2006，15（6）：416-417.

[3] 陳傳好，湯錦波，吳亞芳，等. 微量注射不同載體轉(zhuǎn)基因至損傷肌腱的效率、分布和組織反應(yīng)［J］. 中華創(chuàng)傷雜志，2009，25（1）：71-76.

[4] TANG J B，WU Y F，CAO Y，et al. Basic FGF or VEGF gene therapy corrects insufficiency in the intrinsic healing capacity of tendons［J］. Sci Rep，2016，6：20643.

[5] MAO W F，WU Y F，YANG Q Q，et al. Modulation of digital flexor tendon healing by vascular endothelial growth factor gene transfection in a chicken model［J］. Gene Ther，2017，

24（4）：234-240.

[6] JIN J，YANG Q Q，ZHOU Y L. Non-viral delivery of gene therapy to the tendon［J］. Polymers （Basel），2022，14（16）：3338.

[7] YANG Q Q，SHAO Y X，ZHANG L Z，et al. Therapeutic strategies for flexor tendon healing by nanoparticle-mediated co-delivery of bFGF and VEGFA genes［J］. Colloids Surf B Biointerfaces，2018，164：165-176.

[8] YANG Q Q，CHEN J，ZHOU Y L，et al. The influence of a nanoparticle gel loaded with siRNA-cyclooxygenase on flexor tendon healing： an in vivo animal study［J］. J Hand Surg Eur Vol，2022，47（10）：1064-1070.

[9] ZHOU Y L，YANG Q Q，YAN Y Y，et al. Gene-loaded nanoparticle-coated sutures provide effective gene delivery to enhance tendon healing［J］. Mol Ther，2019，27（9）：1534-1546.

[10] 陳傳好，吳亞芳，曹怡，等. 不同載體轉(zhuǎn)基因效率及AAV2介導(dǎo)bFGF基因在肌腱中表達(dá)的研究［J］. 中國臨床解剖學(xué)雜志，2009，27（2）：195-198.

[11] ZHOU Y L，YANG Q Q，YAN Y Y，et al. Localized delivery of miRNAs targets cyclooxygenases and reduces flexor tendon adhesions［J］. Acta Biomater，2018，70：237-248.

[收稿日期] 2023-02-09

（本文編輯 ? 趙喜）