PIWI相互作用RNA017724在肝細胞癌中的表達及其對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

吳依靖 王婕 王浩 陳琳 王慧璇 居林玲 袁柳霞 李民 王峰

[摘 ? 要] ? 目的：分析PIWI相互作用RNA017724在肝細胞癌組織、人肝癌細胞系中的表達及其對細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。方法：采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測肝細胞癌組織和肝癌細胞系中PIWI相互作用RNA017724的表達水平。將PIWI相互作用RNA017724模擬物和抑制劑轉染SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞，采用CCK-8法和細胞集落形成實驗檢測各組細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Transwell實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力。結果：肝癌組織中PIWI相互作用RNA017724表達水平顯著低于匹配的相鄰正常肝組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；PIWI相互作用RNA017724低表達患者的生存期較短。PIWI相互作用RNA017724抑制劑促進SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞的增殖、遷移和侵襲，而模擬物抑制SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞的增殖、遷移和侵襲。PIWI相互作用RNA017724對細胞凋亡無明顯作用。結論：PIWI相互作用RNA017724抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。

[關鍵詞] ? 肝細胞癌；PIWI相互作用RNA017724；增殖；遷移；侵襲；凋亡

[中圖分類號] ? R735.7 [文獻標志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.003

The expression of piRNA-017724 inhepatocellular carcinoma andits effects

on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration

WU Yijing1，2， WANG Jie1，2， WANG Hao1，2， CHEN Lin2， WANG Huixuan2， JU Linling2， YUAN Liuxia2， LI Min2， WANG Feng3

（1Medical School， Nantong University， Jiangsu 226001; 2Affiliated Nantong ?Hospital 3 of Nantong University/Institute of Liver Diseases， Nantong Third Peoples Hospital; 3Central Lab， Affiliated Hospital of Nantong University）

[Abstract] ? Objective：To explore the expression of piRNA-017724 in hepatocellular carcinoma tissue and human liver cancer cell line， and its effects on cell proliferation， apoptosis， invasion and migration. Methods：Relative piRNA-017724 expression in hepatocellular carcinoma tissue and liver cancer cell line was measured by real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. piRNA-017724 mimic and inhibitor were transfected into SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells. CCK8 method and cell colony formation assay were used to detect cell proliferation， flow cytometry was used to detect cell apoptosis， and Transwell assay was performed to detect cell migration and invasion. Results：piRNA-017724 in hepatocellular carcinoma tissue was significantly lower than that in adjacent normal liver tissue， the difference was statistically significant（P＜0.05）; and the patients with low expression of piRNA-017724 had shorter survival. The piRNA-017724 inhibitor promoted the proliferation， migration and invasion of SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells， while the piR-hsa-017724 mimic inhibited the proliferation， migration and invasion of SMMC-7721 and PLC/PRF/5 cells. However， piRNA-017724 had no affect on cell apoptosis. Conclusions：piRNA-017724 inhibits the proliferation， migration and invasion of HCC cells.

[Key words] ? hepatocellular carcinoma; piRNA-017724; proliferation; migration; invasion; apoptosis

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占絕大多數。HCC的危險因素包括自身免疫性肝炎、酗酒、糖尿病和慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染[1-3]。雖然近年來涌現許多HCC免疫療法和靶向治療，但患者總體預后仍較差，術后復發和轉移率很高[4-6]。HCC中存在多種基因表達變化，識別在發病機制中具有重要作用的基因有助于開發有效治療靶點。近年來，PIWI與RNA相互作用成為新的研究熱點。研究表明，PIWI相互作用RNA可能在癌癥的發展中發揮重要作用，并可能作為診斷和預后的生物標志物[7-10]。RIZZO等[11]發現PIWI相互作用RNA 017724（piRNA-017724）在肝細胞肝癌中異常表達。本研究選取南通大學附屬南通第三醫院/南通市第三人民醫院行肝癌根治術45例肝癌組織及其匹配的相鄰正常肝組織，分析PIWI相互作用RNA 017724的表達水平及其與預后的相關性，探索其在HCC發病機制中的潛在作用。

1 ? 資料與方法

1.1 ? 一般資料 ? 肝癌患者45例，經病理證實均為肝細胞癌，其中男性36例，女性9例，≤50歲13例，＞50歲32例；血清AFP≤20 ng/mL 18例，＞20 ng/mL 27例；腫瘤直徑≤3 cm 1例，＞3 cm 44例；無侵襲32例，發生侵襲13例；腫瘤TNM分期I/II期11例，III/IV期34例。本研究經南通市第三人民醫院臨床研究倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 ? 細胞培養 ? 永生LO2人肝細胞、人肝癌細胞系（SMMC-7721、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、Huh-7、MHCC-97H、HCC-LM3）均購自上海細胞庫。將LO2細胞、SMMC-7721、Li-7細胞置于RPMI-1640培養基（Gibco）中培養，PLC/PRF/5、SK-HEP-1細胞在添加碳酸氫鈉和丙酮酸鈉的MEM培養基中培養，Huh-7、MHCC-97H、HCC-LM3細胞在Dulbecco改良伊格爾培養基（Gibco）中培養，所有培養基均添加10%胎牛血清（Cell Sciences，Canton，MA），在37 °C、5%CO2培養箱中培養。

1.3 ? 實時定量PCR（RT-qPCR）檢測 ? 使用Trizol試劑從細胞和手術切除肝癌組織及其匹配的相鄰正常肝組織中提取總RNA，使用Bulge-LoopTM qPCR試劑盒（銳博生物，中國廣州）進行RT-qPCR，檢測PIWI相互作用RNA017724的表達水平。采用U6小核RNA作為內參對照，RNA相對表達量以冪值（2-△△Ct）計算。

1.4 ? 細胞轉染 ? PIWI相互作用RNA017724模擬物和抑制劑及相應的陰性對照物由銳博生物合成。將SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞接種在6孔板中，培養過夜。分為過表達PIWI相互作用RNA017724組（mi-017724）及其空白對照組（mi-NC），敲低PIWI相互作用RNA017724組（in-017724）及其空白對照組（in-NC）。根據制造商說明書，兩種溶液混合后，將混合物添加到6孔板中。轉染48 h后收集細胞，進行后續實驗。

1.5 ? 細胞增殖試驗 ? 采用CCK-8法檢測細胞活力，按照試劑盒（Sigma，USA）說明書操作。將轉染48 h的肝癌細胞用胰蛋白酶消化，以每孔3×103個細胞密度接種到96孔板，培養過夜。每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 °C孵育2.5 h。在酶標儀（Thermo Fisher，USA）450 nm處測量吸光度。

1.6 ? 細胞集落形成試驗 ? 轉染48 h的肝癌細胞經胰蛋白酶化，制備單細胞懸液，以每孔2 000個細胞密度接種到6孔板中。每3天更換1次培養基，培養2周以獲得細胞集落。磷酸鹽緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定液固定，結晶紫染色。洗滌并在空氣中干燥后，對細胞集落進行拍照和計數。

1.7 ? 細胞凋亡檢測 ? 應用Annexin V/7-AAD Apoptosis Detection Kit（BD公司，美國）對細胞進行染色，使用FlowJo軟件（BD公司）通過流式細胞術評估細胞凋亡。

1.8 ? Transwell試驗 ? 采用transwell室（Corning公司，NY，USA）測試細胞侵襲和遷移能力。轉染48 h后肝癌細胞經胰蛋白酶消化，收集后離心，基培重懸。以每孔2×105個細胞接種到小室中，將600 μL含20%FBS培養基加至下室中。37 °C、5%CO2培養箱中培養24 h，用棉簽去除transwell膜上表面的殘留細胞。transwell膜下表面遷移的細胞用4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，結晶紫染色8 min。侵襲實驗需在transwell膜預涂基質膠（BD Biosciences，USA）。用光學顯微鏡（Olympus，Japan）對transwell膜下表面的細胞進行拍照，計算3個隨機視野的細胞數。

1.9 ? 統計學處理 ? 應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以■±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 ? 結 ? ? ?果

2.1 ? 肝癌組織中PIWI相互作用RNA017724表達及其與患者預后的關系 ? RT-qPCR檢測顯示，與正常肝組織比較，肝癌組織中PIWI相互作用RNA017724低表達，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖1A）。根據PIWI相互作用RNA017724臨界值，將45例患者分為PIWI相互作用RNA017724-high組和low組，結果顯示PIWI相互作用RNA017724水平與患者的預后密切相關，與高表達組患者比較，低表達組患者生存期較短，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 ? 肝癌細胞PIWI相互作用RNA017724表達及轉染效果 ? RT-qPCR檢測顯示，與正常LO2肝細胞比較，各肝癌細胞系PIWI相互作用RNA017724表達顯著減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2A）。SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞轉染PIWI相互作用RNA017724抑制劑后，PIWI相互作用RNA017724表達降低，轉染PIWI相互作用RNA017724模擬物后，PIWI相互作用RNA017724表達增加（圖2B、C），說明轉染成功。

2.3 ? PIWI相互作用RNA017724抑制肝癌細胞增殖能力 ? CCK-8實驗顯示，抑制PIWI相互作用RNA017724表達后SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞活力顯著增加，而增加PIWI相互作用RNA017724表達后兩種細胞活力降低（圖3A、B）。細胞集落形成實驗顯示，PIWI相互作用RNA017724降低SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞集落數量（圖3C、D）。

2.4 ? PIWI相互作用RNA017724表達對肝癌細胞凋亡的影響 ? 流式細胞儀檢測發現，過表達PIWI相互作用RNA017724和敲除PIWI相互作用RNA017724對SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞凋亡無顯著影響（圖4）。

2.5 ? PIWI相互作用RNA017724抑制肝癌細胞遷移和侵襲能力 ? transwell實驗顯示，與in-NC組比較，敲低PIWI相互作用RNA017724表達增加SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞的遷移能力，而與mi-NC組比較，PIWI相互作用RNA017724過表達抑制SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞的遷移能力（圖5A、B）。與mi-NC組比較，PIWI相互作用RNA017724過表達抑制SMMC-7721和PLC/PRF/5細胞的侵襲能力，而與in-NC組比較，抑制PIWI相互作用RNA017724表達增強細胞侵襲能力（圖5C、D）。表明PIWI相互作用RNA017724可以抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

3 ? 討 ? ? ?論

PIWI相互作用RNA是一類新發現的小非編碼RNA（ncRNA）[12-13]，迄今為止已鑒定出20 000多個PIWI相互作用RNA[14-15]。一些研究表明，PIWI相互作用RNA在生殖細胞中廣泛表達。高通量測序表明，PIWI相互作用RNA信號通路在人類癌細胞中也很活躍[16-20]，可能在癌癥發展過程中發揮作用。PIWI相互作用RNA通過調節轉錄和轉錄后水平的基因表達影響癌細胞多種過程，包括細胞凋亡、增殖、遷移和侵襲[17，21]。已證明，PIWI相互作用RNA通過直接結合PIWI蛋白表現出促癌或抗癌作用[22]。PIWI相互作用RNA的異常表達與多種癌癥有關，可能參與癌癥發生、發展和轉移。PIWI相互作用RNA與胃癌的惡性程度密切相關，胃癌組織中PIWI相互作用RNA651和PIWI相互作用RNA823異常表達與患者預后密切相關，可作為胃癌的診斷工具或治療靶點[23-25]。PIWI相互作用RNA在乳腺癌的發病中具有重要作用[26-28]。PIWI相互作用RNA與腎癌的轉移和預后密切相關[29-31]。PIWI相互作用RNA作為結直腸癌診斷工具和治療靶點具有重要臨床意義[32-37]。PIWI相互作用RNA55490在肺癌組織中的表達降低，抑制PIWI相互作用RNA55490表達可以通過抑制肺癌細胞中mTOR通路的激活來促進肺癌細胞的增殖。這表明PIWI相互作用RNA55490在肺癌的發生中可能具有抗癌作用[19]。PIWI相互作用RNA651參與非小細胞肺癌的發生、侵襲和轉移，可能是一種潛在的癌癥診斷工具[38-40]。

既往研究表明，PIWI相互作用RNA017724在肝細胞癌中異常表達。本研究結果顯示，PIWI相互作用RNA017724在肝細胞癌組織中顯著下調，PIWI相互作用RNA017724低表達患者預后較差。當上調PIWI相互作用RNA017724時，肝癌細胞侵襲、遷移和增殖能力受到抑制，下調PIWI相互作用RNA017724則促進腫瘤細胞侵襲、遷移和增殖。有研究表明，上皮間充質轉化（EMT）[41]、WNT/β-連環蛋白通路[42-43]影響細胞增殖、侵襲和遷移。推測PIWI相互作用RNA017724可能通過這些途徑影響肝細胞癌的發生發展，有待后續進一步實驗研究。PIWI相互作用RNA017724在HCC的發生和發展中發揮重要作用，并可能作為診斷和預后的生物標志物。

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[收稿日期] 2022-12-13

（本文編輯 ? 趙喜）