蘇州地區(qū)獻(xiàn)血者血小板HPA基因分型與CD36表型的研究

王儀含 何紅紅 金一鳴 段寶生 王玉玨 湯龍海

[摘 ? 要] ? 目的：進(jìn)一步研究蘇州地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA基因分型及其CD36抗原表型，為建立本地區(qū)血小板資料庫及提高臨床血小板輸注有效性提供依據(jù)。方法：采用多重?zé)晒釶CR法對(duì)564例單采血小板獻(xiàn)血者抗凝全血標(biāo)本進(jìn)行HPA-1～6，10，15，21基因分型檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血小板CD36抗原表達(dá)，借助流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD36陰性標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)和表型分型。結(jié)果：564份標(biāo)本中HPA-3、15基因型的雜合程度最高，其等位基因頻率分別為HPA-3a 0.594、3b 0.406、15a 0.5275、15b 0.4725。蘇州地區(qū)HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州、黑龍江差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD36陰性標(biāo)本12例（2.13%），其中1例為Ⅰ型CD36缺失，11例為II型CD36缺失。結(jié)論：蘇州地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA基因型分布具有高度多態(tài)性，并存在種族和區(qū)域差異。

[關(guān)鍵詞] ? 單采血小板固定獻(xiàn)血者；人類血小板特異性抗原；CD36抗原；血小板無效輸注

[中圖分類號(hào)] ? R446.11 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] ? B [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.017

血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原，包括ABO系統(tǒng)抗原、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人類血小板特異性抗原（human platelet antigen，HPA）、CD36（glycoprotein Ⅳ，GP Ⅳ）抗原以及其它一些糖蛋白抗原[1]。HPA抗原由血小板特有抗原決定簇組成，是存在于血小板膜糖蛋白上具有獨(dú)特遺傳多態(tài)性的蛋白分子[2]，它的多態(tài)性是由于單個(gè)堿基取代而導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變而產(chǎn)生。利用HPA基因分型檢測(cè)，可進(jìn)行同種型別血小板個(gè)體輸注，從而有效降低產(chǎn)生血小板抗體的幾率。血小板表面另一種重要的糖蛋白分子是CD36抗原，又名NaKa抗原，在亞裔人群中缺失頻率相對(duì)較高，而在高加索人群缺失率較低[3]。HPA和CD36抗原是除HLA外造成免疫性血小板輸注無效的重要因素。由于HPA基因多態(tài)性及CD36抗原缺失，患者在輸血、移植、妊娠等免疫刺激下，易發(fā)生同種免疫性反應(yīng)，造成血小板輸注無效、胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥、輸血后紫癜等[4]。因此，本文隨機(jī)選取2022年2—6月蘇州市中心血站單采血小板固定獻(xiàn)血者（捐獻(xiàn)血小板次數(shù)≥3次/年）564例，對(duì)蘇州地區(qū)HPA抗原基因分型和CD36抗原缺失頻率進(jìn)行分析，以期為建立本地區(qū)血小板資料庫及提高臨床血小板輸注有效性提供重要依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 研究對(duì)象 ? 單采血小板固定獻(xiàn)血者（捐獻(xiàn)血小板次數(shù)≥3次/年）564例，男性541例，女性23例，年齡20～55周歲，平均34.7±7.5周歲。籍貫分布在江蘇省內(nèi)各地區(qū)，均為漢族，本實(shí)驗(yàn)獲蘇州市中心血站醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采集獻(xiàn)血者靜脈血5 mL，EDTA抗凝，放置-40 ℃冰箱保存，于2022年7月一次性完成全部檢測(cè)。

1.2 ? 試劑與儀器 ? DNA提取試劑盒（批號(hào)：MYYTW

9901，北京天根生化科技有限公司）；人類血小板特異性抗原基因分型檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202110A，江蘇偉禾生物科技有限公司）；人類血小板CD36抗原檢測(cè)試劑盒（ELISA法，中科院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究惠贈(zèng)）；PE熒光標(biāo)記抗人CD36單克隆抗體、FITC熒光標(biāo)記抗人CD14單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗人IgG抗體（批號(hào)：336206、325604、403503，Biolegend，上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞儀（DxFlex，美國Beckman Coulter公司）。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? DNA提取：取獻(xiàn)血者抗凝全血標(biāo)本250 μL，按試劑盒說明書提取DNA，濃度為30～50 ng/mL，A260/A280值為1.6～2.0。

1.3.2 ? HPA基因分型：按照試劑盒說明書，配置混合母液，包含HPA主反應(yīng)液3 ?μL、HPA酶混合液0.4 μL、滅菌水12.6 μL。于每個(gè)反應(yīng)孔中加入16 μL混合母液和2 μL DNA，放入熒光定量PCR儀（CFX96，BIORAD）中檢測(cè)。根據(jù)HPA亞型探針熒光標(biāo)識(shí)表，如擴(kuò)增曲線正常且Ct＜32判斷相應(yīng)的HPA亞型為陽性，無擴(kuò)增曲線升起或Ct≥32判斷相應(yīng)的HPA亞型為陰性，擴(kuò)增曲線異常則需重新檢測(cè)。

1.3.3 ? 血小板CD36抗原檢測(cè)：采用ELISA法，向反應(yīng)微孔板中加入待檢、陽性及陰性對(duì)照血小板懸液，按試劑盒說明書要求初篩獻(xiàn)血員血小板CD36表達(dá)。將ELISA法初篩陰性標(biāo)本采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行確認(rèn)：取血小板懸液標(biāo)記PE抗人CD36單克隆抗體，室溫避光孵育15～20 min，經(jīng)洗滌、離心、重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.3.4 ? 單核細(xì)胞表面CD36抗原檢測(cè)：對(duì)流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)的血小板CD36陰性標(biāo)本，進(jìn)一步標(biāo)記FITC抗人CD14單克隆抗體和PE抗人CD36單克隆抗體，檢測(cè)單核細(xì)胞CD36的表達(dá)，確認(rèn)CD36缺失表型。

1.4 ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ? HPA基因型頻率=統(tǒng)計(jì)陽性數(shù)（aa/ab/bb）/統(tǒng)計(jì)總?cè)藬?shù)（n），a基因頻率=（aa+ab/2）/n，b基因頻率=（bb+ab/2）/n，并作Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度驗(yàn)證；不配合率（MP）=2ab（1-ab）（a、b分別代表a和b的等位基因頻率）。與國內(nèi)其他地區(qū)漢族人群HPA-1～6和HPA-15等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD36的表達(dá)分析采用FlowJo V10軟件。

2 ? 結(jié) ? ? ?果

2.1 ? HPA-1～6、10、15、21系統(tǒng)基因型及等位基因頻率 ? 在564例標(biāo)本中HPA-10未檢出b等位基因，但發(fā)現(xiàn)HPA-3bb、HPA-15bb純合基因型。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，該系統(tǒng)基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表1。

2.2 ? 蘇州地區(qū)HPA-1～6、15、21基因頻率與國內(nèi)外其他地區(qū)的比較 ? 蘇州地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血員HPA-1～6、15、21系統(tǒng)基因分布頻率與張若洋等[5]報(bào)道的結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州[7]、黑龍江差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 ? 血小板CD36抗原檢測(cè)結(jié)果 ? 經(jīng)ELISA檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)，564例標(biāo)本中CD36抗原陽性552例（97.87%），陰性12例（2.13%），CD36缺失率2.13%，其中Ⅰ型CD36缺失1例（8.33%），Ⅱ型CD36缺失11例（91.67%）。

3 ? 討 ? ? ?論

由于HPA存在遺傳多態(tài)性，且HPA基因在不同種族、不同地區(qū)人群中的分布存在差異，因此HPA抗原在血小板輸注中引起同種免疫的風(fēng)險(xiǎn)具有一定的地域特征[6]，引發(fā)的血小板免疫性疾病的幾率也有差異。分析本地區(qū)人群HPA基因多態(tài)性特點(diǎn)可為臨床需要時(shí)提供基因型配合的血小板，對(duì)血小板輸注意義重大。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光PCR法結(jié)合Taqman探針技術(shù)對(duì)564例單采血小板獻(xiàn)血員標(biāo)本HPA-1～6、10、15、21基因進(jìn)行定性分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HPA-3、15系統(tǒng)有aa、ab、bb 3種表型且雜合程度最高。HPA-1a、2a、4a、5a、6a和21a為本組高頻抗原等位基因，以aa純合子為主，HPA-1b、2b、4b、5b、6b和21b為低頻抗原等位基因，以雜合子形式為主，其中HPA-10系統(tǒng)呈單特異性僅有HPA-10 aa，未檢測(cè)出相應(yīng)的b對(duì)偶基因。蘇州地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血員HPA-1～6、10、15、21系統(tǒng)基因分布頻率與張若洋等[5]報(bào)道的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明中國人群由HPA-1a引起的血小板輸注無效較少見。蘇州地區(qū)HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州[7]、黑龍江的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明HPA在中國人群中的分布存在一定的地域性。蘇州地區(qū)HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道相似。

本研究結(jié)果顯示，蘇州地區(qū)HPA-3和15系統(tǒng)不配合率分別為0.3660、0.3743，我國其他地區(qū)不配合率都較高[8]，HPA-2、HPA-5不配合率是導(dǎo)致血小板無效輸注的主要抗原系統(tǒng)。本研究結(jié)果僅顯示HPA-5系統(tǒng)不配合率存在地區(qū)差異，蘇州地區(qū)HPA-5不配合率低于廣州地區(qū)[8]（5a基因頻率0.9731，5b基因頻率0.0269，不配合率0.0510）和中國南方[8]（5a基因頻率0.997，5b基因頻率0.003，不配合率0.0582），高于中國北方[8]（5a基因頻率0.9932，5b基因頻率0.0068，不配合率0.01351）和吉林地區(qū)[9]（5a基因頻率0.998，5b基因頻率0.002，不配合率0.004），也進(jìn)一步證實(shí)HPA系統(tǒng)的地區(qū)差異性。因此，各地區(qū)建立血小板HPA基因資料庫，重點(diǎn)關(guān)注各系統(tǒng)的配合，對(duì)臨床血小板輸注效果發(fā)揮積極作用。

除了HPA系統(tǒng)，近年來亞洲人群血小板CD36抗原缺失引起的輸注無效及并發(fā)癥也引起廣泛的關(guān)注。CD36抗原缺失分為2種類型，即Ⅰ型（血小板和單核細(xì)胞均不表達(dá)CD36）和Ⅱ型（僅血小板不表達(dá)CD36）缺失。我國不同地區(qū)CD36缺失比例為0.75%～4.1%[10]，其中廣州、廣西、深圳、上海和浙江的CD36抗原缺失頻率平均為3.45%，以廣西、浙江頻率較高。本組標(biāo)本CD36抗原缺失率為2.13%，與本血站前期調(diào)查結(jié)果2.48%較為相近[3]，其中Ⅰ型缺失占8.33%，Ⅱ型缺失占91.67%。通過此次篩查，我們將重點(diǎn)關(guān)注臨床輸注血小板無效的原因，為由于CD36抗原缺失產(chǎn)生同種免疫抗體導(dǎo)致血小板輸注無效的患者提供陰性血小板，以提高血小板輸注效果。

綜上所述，通過對(duì)蘇州地區(qū)564例單采血小板獻(xiàn)血員HPA基因分型和CD36抗原表型研究，進(jìn)一步證實(shí)血小板抗原的基因分布具有高度多態(tài)性，并存在種族和區(qū)域差異。下一步我們將對(duì)反復(fù)輸注血小板的患者進(jìn)行血小板抗體篩查，了解該類患者血小板無效輸注的免疫因素，制定相應(yīng)的輸血策略。

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[收稿日期] 2023-01-03

（本文編輯 ? 繆宏建）