vlPAG中GABA能神經元參與電針緩解IBS小鼠內臟痛的機制研究*

王馨悅，翁志軍，劉慧榮，吳璐一，韓冬，柴菁，彭洋，馬金丹，吳煥淦，張方

（1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海市針灸經絡研究所，上海 200030）

光遺傳技術作為一種新興技術，融合了光學、遺傳學和分子生物學技術的優勢，能夠將光敏感蛋白表達在某個特定的神經元中，通過不同波長和頻率的光刺激來改變蛋白功能，實現興奮或抑制神經元活動的目的[1-2]。光遺傳技術廣泛用于中樞神經環路研究[3]，通過操控腦內神經環路的方式實現對個體行為影響，該方法極大地推動了神經科學研究的發展。近年來，光遺傳技術逐漸獲得疼痛領域研究者的關注，Chen 等[4]利用光遺傳技術發現，臂旁核中存在谷氨酸能和γ-氨基丁酸（GABA）能神經纖維能夠直接投射至延髓頭端腹內側區（RVM）的神經元，調控傷害性刺激信息，對生理和病理情況下的疼痛進行調節。王若曦[5]使用含DTA 元件病毒，利用光遺傳技術特異性地損毀了Gper1-Cre 小鼠RVM的ON 細胞，通過抑制下行易化系統從而抑制了慢性炎性痛、熱痛和內臟痛。

腸易激綜合征（IBS）作為一種功能性胃腸病，主要癥狀為反復發作的腹痛，并伴有糞便性狀或排便習慣的改變，在全球人口中的發病率為11.2%，其發病機制尚不明確[6]。目前普遍認為內臟高敏感是IBS 的主要生理病理機制之一[7]，并與IBS 患者腹痛癥狀密切相關[8]。中腦導水管周圍灰質（PAG）是內臟疼痛調節神經環路的一個關鍵部位[9]，共分為4 區，分別是背內側區（dmPAG）、背外側區（dlPAG）、外側區（lPAG）和腹外側區（vlPAG）。肖智[10]研究表明，lPAG 神經元上的P2X3受體在脊髓上中樞對疼痛的調節方面起抑制作用，電針“足三里”穴位通過上調lPAG 中P2X3受體表達緩解慢性坐骨神經結扎模型（CCI）大鼠的神經痛癥狀。lPAG 中P2X3受體介導了電針鎮痛的脊髓上調節機制。以vlPAG 為核心的痛覺下行抑制系統近年來被認為和電針鎮痛密切相關[11]，本課題組前期研究發現電針能夠緩解IBS大鼠腸道內臟痛，為了進一步研究vlPAG 中GABA能神經元是否參與電針緩解IBS小鼠內臟痛的機制，本研究利用光遺傳技術對IBS 內臟痛小鼠的vlPAG腦區的GABA 能神經元進行激活/抑制調控，探討vlPAG中GABA能神經元在電針緩解IBS小鼠內臟痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究選用雄性Vgat-Cre 小鼠30 只，體質量（20±2）g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[動物許可證號：SCKX（滬）2019-0002]，飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心，已通過動物實驗倫理審批（編號YYLAC-2021-143-2），飼養環境：12 h 晝夜節律交替，飼養室溫度（20±2）℃，相對濕度50%～70%。適應性飼養1 周后開始實驗，實驗過程中對實驗動物的所有操作均符合動物福利的基本要求。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，Sigma，美國）；礦物油（M5310，Sigma，美國）；液體石蠟、生理鹽水、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，中國）；韓式經穴刺激儀（濟生醫療有限公司，中國）、rAAV2/9-EF1α-DIO-hChR2（H134R）-EGFP、rAAV2/9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EGFP（和元生物技術有限公司，中國）；醫用眼膏（上海通用藥業，中國）；異氟烷、移動式小動物麻醉機、顱鉆、冷光源、微量注射泵、玻璃電極、小鼠適配器、桌面數顯腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司，中國）；有線光遺傳系統（熒博杭州科技有限公司，中國）；陶瓷插芯、陶瓷套管（千奧星科南京生物科技有限公司，中國）；電極拉制儀P-1000（Sutter Instruments，美國）；體式顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 IBS 動物模型制備 根據隨機數字表法，將Vgat-Cre 小鼠分為正常組（n=6）和造模組（n=24）。造模組小鼠采用TNBS 灌腸法制備IBS 內臟痛模型，具體操作參考Hughes 等[12]方法：采用130 μg/mL的TNBS 溶液0.1 mL 灌腸制備IBS 內臟痛模型。實驗動物模型制備前禁食24 h，不禁水。

1.4 分組與干預 將造模組小鼠隨機分為模型組、模型+eNpHR 組、模型+ChR2 組、電針組，同時設立正常組，每組6 只。各組將進行以下處理：1）正常組。不進行模型制備，在電針組治療同時每次給予同電針組相同的抓取與固定，連續干預7 d。2）模型組。模型制備21 d 后，在電針組治療過程中每次給予同電針組相同的抓取與固定，連續干預7 d。3）電針組。模型制備21 d 后，進行電針治療。取穴：雙側“足三里”穴[13]，針刺深度為3～4 mm。韓式經穴刺激儀參數：疏密波，頻率2/100 Hz，電流1mA，每次30 min，每日1 次，連續電針7 d。4）模型+eNpHR組。模型制備7 d 后，腦立體定位注射rAAV2/9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EGFP 病毒；病毒注射21 d后給予持續黃光刺激（20 Hz，5 ms，4 mW）[14]。5）模型+ChR2 組。模型制備7 d 后，腦立體定位注射rAAV2/9-EF1α-DIO-hChR2-EGFP 病毒；病毒注射21 d 后給予特定程序藍光刺激（20 Hz，5 ms，4 mW）[15]。

1.5 動物手術

1.5.1 麻醉及術前準備 在小鼠立體定位儀底板上放置加熱墊，溫度保持在（37±1）℃，使小鼠在手術中維持體溫恒定。采用電極拉制儀拉制玻璃電極，吸入約300 nL 病毒后將電極夾持在腦立體定位儀上。將氧氣濃度調節至0.8%～1.0%，異氟烷濃度調節至1.2%～1.5%，將小鼠放入誘導盒中，待小鼠呼吸頻率變慢、呼吸平穩、夾尾反應和翻身反應消失后認為此次誘導麻醉成功，將小鼠置于加熱墊上，調整鼻夾并固定耳桿使小鼠頭部固定且不影響其正常呼吸。打開冷光源，小鼠雙眼均勻涂抹醫用眼膏，保持小鼠雙眼全程濕潤。

1.5.2 腦立體定位、病毒注射 剃去小鼠顱骨上方毛發，清除小鼠頭部皮下組織和筋膜，暴露顱骨表面骨縫、前囟（Bregma）點、人字縫尖（Lambda）點。在體式顯微鏡下用腦立體定位儀將顱骨前、后、左、右4 個方位精確調平在同一水平面上，隨后移動電極至小鼠顱骨表面，根據vlPAG 的坐標：Bregma 點向后4.8 mm，中線旁開-0.6 mm，顱骨表面朝腹側向下2.8 mm，用顱骨鉆輕旋磨出顱窗，暴露腦組織，用眼科鑷輕輕夾除腦組織上方的硬腦膜。最后，移動玻璃電極使其勻速緩慢下降，以每10 nL/min 的速率緩慢將病毒注入vlPAG 腦區，每只小鼠注射300 nL，在注射過程中時刻觀察，防止病毒溢出和注入空氣。注射完成后將玻璃電極尖端在腦組織中停留10 min 后緩慢出針，防止病毒隨電極尖端溢出。

1.5.3 陶瓷插芯 植入固定病毒注射完成后，在腦立體定位儀上固定陶瓷插芯，將光纖緩慢植入小鼠vlPAG 腦區。用牙科水泥將陶瓷插芯和顱骨黏合，21 d 后進行后續實驗。術后每只小鼠單籠飼養1 周，并密切觀察小鼠排尿、排便是否正常，手術部位有無出血、感染，陶瓷插芯是否掉落。同時保持環境溫度適宜，墊料干凈、干燥。

1.5.4 腹壁撤回反射（AWR）評分 造模后第21 天對正常組和模型組小鼠進行AWR 評分，鑒定模型制備是否成功。造模后第28 天對模型+eNpHR 組、模型+ChR2 組給光前后進行AWR 評分，鑒定光遺傳技術激活/抑制GABA 能神經元是否成功；對模型組、電針組小鼠進行AWR 評分，觀察電針對IBS 內臟痛小鼠的作用。

評分前將小鼠禁食、不禁水24 h。將自制的球囊蘸取液體石蠟后，沿小鼠肛門緩慢插至降結腸部分并固定，隨后將小鼠放入透明小鼠固定盒中適應30 min，待小鼠安靜后，用注射器將血壓計壓力值分別升至15、30、45、60 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa，下同），維持壓力刺激20 s，不同壓力刺激間隔30 s，每次循環后休息3min，共進行3 個循環。取3 次評分的平均值作為該球囊壓力下的最終評分值。參照Alchaer 等[16]的評分標準對小鼠球囊擴張刺激反應進行評分。0 分：對球囊擴張無反應；1 分：刺激開始時，小鼠偶有扭頭，結直腸擴張（CRD）期間保持不動；2 分：腹肌微微收縮，但無腹肌抬起；3 分：腹肌強烈收縮伴抬起，但無盆腔及陰囊抬起；4 分：身體弓起，盆腔及陰囊抬起。

1.5.5 行為學檢測中的光遺傳技術 模型+eNpHR組和模型+ChR2 組小鼠在病毒注射21 d 后進行光遺傳給光刺激。刺激前使用激光功率計對激光強度進行檢測，需要達到20～30 mW 后才可滿足進行神經操控的強度，光纖跳線通過套管與小鼠顱骨的陶瓷頭進行連接，使用光遺傳控制軟件進行激光刺激。光遺傳589 nm 黃色激光刺激方案參考Tovote等[14]方法，給予持續黃光刺激（20 Hz，5 ms，4 mW）；光遺傳473 nm 藍色激光刺激方案參考Bennett 等[15]對vlPAG 腦區神經元的刺激方法，給予相應的脈沖刺激，即藍光刺激（20 Hz，5 ms，4 mW）5 s 和休息15 s（無藍光刺激），避免神經元的過度興奮和興奮性毒性。在給予程序刺激前和刺激過程中進行AWR 行為學檢測。

1.6 統計學分析 實驗采用SPSS26.0 軟件對數據進行統計學分析。對數據進行正態分布檢驗，符合正態分布數據采用均值±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析；非正態分布的數據用中位數（上四分位數，下四分位數）[M（Q25，Q75）]表示，兩組間比較采用Mann-Whitney 檢驗，多組比較采用Kruskal Wallis 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠干預前AWR 評分比較 各組小鼠干預前AWR 評分結果顯示，與正常組比較，在15、30、45、60 mmHg 的CRD 刺激下，模型組小鼠AWR評分明顯增加（P＜0.01），提示IBS 內臟痛小鼠模型制備成功。見表1。

表1 正常組與模型組小鼠干預前不同壓力等級下AWR 評分比較[M（Q25，Q75）]分

2.2 各組小鼠干預后AWR 評分比較 造模后第28 天進行光遺傳刺激時進行AWR 評分，比較給光前、給光時小鼠AWR 評分。統計結果顯示，與給光前比較，在15、30 mmHg 刺激強度下，模型+eNpHR組小鼠接受黃光刺激時，AWR 評分上升（P＜0.05）；在45、60 mmHg 刺激強度下，AWR 評分與給光前比較上升，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 模型+eNpHR 組小鼠干預前后不同壓力等級下AWR 評分比較[M（Q25，Q75）]分

與給光前比較，在15、30、45 mmHg 刺激強度下，模型+ChR2 組小鼠在給予藍光刺激時，AWR 評分下降（P＜0.01）；在60 mmHg 刺激強度下，AWR 評分較給光前下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 模型+ChR2 組小鼠干預前后不同壓力等級下AWR 評分比較[M（Q25，Q75）]分

比較光遺傳干預后各組小鼠AWR 評分，統計結果顯示，與正常組比較，在15、30、45、60 mmHg 刺激強度下，模型組小鼠AWR 評分增加（P＜0.01），從行為學角度說明IBS小鼠內臟痛模型制備成功。與模型組比較，模型+eNpHR 組小鼠在15 mmHg 刺激強度下，AWR 評分上升（P＜0.05）；在30 mmHg 刺激強度下，AWR 評分上升（P＜0.01）；在45、60 mmHg刺激強度下，AWR 評分上升，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，模型+ChR2 組在15、30、45 mmHg 刺激強度下，AWR 評分下降（P＜0.01）；在60 mmHg 刺激強度下，AWR 評分下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，電針組小鼠在15 mmHg 刺激強度下，AWR 評分下降，差異無統計學意義（P＞0.05）；在30、45、60 mmHg 刺激強度下，電針組小鼠AWR 評分下降（P＜0.05），從行為學的角度說明電針能夠緩解IBS小鼠內臟痛。見表4。

表4 各組小鼠經光遺傳干預后不同壓力等級下AWR 評分情況[M（Q25，Q75）]分

3 討論

IBS 是目前臨床常見的胃腸道功能性疾病，以內臟痛為主要臨床表現。本研究使用TNBS 溶液制備IBS 內臟痛模型[12]。模型組小鼠在不同級別壓力CRD 誘導下的AWR 評分隨刺激強度增加而升高，內臟敏感性隨之增加，表明本研究IBS 內臟痛小鼠模型制備成功。

目前西醫治療IBS 以對癥治療為主，無法系統性地改善患者整體情況，且部分藥物不良反應明顯，甚至導致缺血性心血管疾病和缺血性結腸炎等嚴重后果[17]。1 項納入17 項臨床研究的Cochrane 系統評價顯示：針刺治療IBS 的有效率高達84%，優于藥物治療的63%[18]。而電針將針刺和電流刺激相結合，通過電針儀增加了電刺激，對IBS 的癥狀改善效果更為顯著[19]。足三里穴為足陽明胃經合穴、胃之下合穴，刺激該穴可疏通局部經絡氣血，通調三焦氣機，治療肚腹疾病。研究表明，電針足三里穴可明顯糾正偏于正常生理狀態的胃腸功能抑制狀態，對胃腸功能起促進作用[20]。課題組以往研究也發現電針能夠抑制內側丘腦和前扣帶皮層中星形膠質細胞的活化，緩解IBS 內臟痛。此外，另有研究發現，電針干預足三里穴可以恢復結腸慢波的頻率和節律，達到減輕IBS小鼠內臟高敏感性的目的[21]。

作為介導痛覺信息處理的神經通路中的關鍵部分，vlPAG 在電針鎮痛過程中發揮重要作用[14，22]。本研究利用腦立體定位技術精準定位vlPAG 腦區，采用光遺傳技術改變細胞膜兩側的離子通透性，實現了以毫秒級精度對特定區域中軸突末端的亞細胞定位進行光學調控，這種對神經元進行非侵入式的精確定位刺激操作，為神經科學領域提供了革命性的新研究手段[23]。基于光遺傳技術的獨特優勢，本研究將光遺傳技術與行為學相結合，通過光遺傳技術精準控制vlPAG 腦區中的GABA 能神經元，觀察小鼠AWR 評分變化。采用光遺傳藍光刺激激活vlPAG中GABA能神經元，IBS 內臟痛小鼠AWR 評分顯著下降（P＜0.05）；采用光遺傳黃光刺激抑制vlPAG中GABA能神經元，IBS 內臟痛小鼠AWR 評分顯著上升（P＜0.05），從行為學角度說明vlPAG中GABA能神經元在IBS 內臟痛中發揮重要作用，而電針足三里穴也能夠降低IBS 小鼠AWR 評分，緩解IBS 內臟高敏感狀態，提示vlPAG中GABA能神經元可能參與電針緩解IBS小鼠內臟痛的效應機制。

以上實驗結果說明采用光遺傳的方法調控vlPAG中GABA能神經元具有可靠性，激活GABA能神經元能夠模擬電針的鎮痛作用，電針可能通過vlPAG 中的GABA 能神經元緩解IBS小鼠內臟痛。但本研究只采用行為學評分初步探索了vlPAG中GABA能神經元和IBS 內臟痛的關系，后續仍需采用分子生物學技術進一步研究。