不同促滲劑對芍藥苷凝膠體外透皮吸收的影響

胡遠(yuǎn)康，鐘雨虹，劉志東，祁東利

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617）

芍藥苷（PF）亦稱芍藥花素，來源于芍藥科植物芍藥根，是從中藥赤芍、白芍中分離的一種蒎烷單萜苦味苷。在白芍總苷（TGP）中含量最高，約90%[1]，為白色吸濕性無定形棕褐色粉末（90%為類白色粉末）。現(xiàn)代藥理研究表明，PF 具有抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、防治糖尿病等作用[2-4]。PF 常用于抗炎及鎮(zhèn)痛，有助于臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5-7]。

口服給藥藥動學(xué)研究表明，PF 在胃腸道中吸收情況不佳，生物利用度低，因此改變PF 給藥途徑對提高藥物的體內(nèi)吸收與增強(qiáng)藥物療效，具有非常重要的意義[8-10]。經(jīng)皮吸收制劑可以避免肝臟的首過效應(yīng)，且可以提高患者依從性。但是皮膚作為一道生理屏障，對藥物的透過具有阻礙作用，因此，篩選合適的促滲劑顯得尤為必要。目前，對PF 的研究大多圍繞其藥理活性開展，而對透皮吸收少有報(bào)道[11-13]，且將其制為凝膠劑尚無報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究PF體外經(jīng)皮滲透特性，意在為PF 的制劑設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 儀器、試藥與實(shí)驗(yàn)動物

1.1 儀器 智能磁力加熱攪拌器（SCGL-4B，DTGE1000，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；高效液相色譜（HPLC）儀（1260，VWD，DEACX18632，美國安捷倫公司）；透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（TK-20B 型，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；臺式通用冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher 公司）；去離子水機(jī)（Mill-Q，美國Millipore公司）。

1.2 試藥 PF 對照品（批號：106H021，北京索萊寶科技有限公司，含量>98%）；PF 原料藥（批號：FY00Y0816，南通飛宇生物科技有限公司，含量＞98%）；卡波姆940（批號：20200614，武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司）；藥用甘油（批號：K2019079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；羥苯乙酯（艾勒科技）；三乙醇胺（批號：20210103，成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司）；生理鹽水（批號：21020203B，安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司）；薄荷油（批號：B22N9C75604，上海源葉生物科技有限公司）；桉葉油（批號：B28S9C71133，上海源葉生物科技有限公司）；油酸（藥用級，批號：18513，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水溶性月桂氮卓酮（批號：200701，湖北科捷制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 安捷倫色譜柱：ZORBAX EcLipse Plus，C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A（0.1%磷酸水溶液）-B（乙腈），梯度洗脫：0～9 min，20%～20%B；9～12 min，20%～60%B；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長230 nm；后運(yùn)行時間3 min。

2.1.2 專屬性考察 取12 h 空白PF 凝膠透皮接受液、PF 凝膠透皮接受液、PF 對照品溶液。按照“2.1.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣分析，記錄HPLC 圖，結(jié)果表明該方法專屬性良好。見圖1。

2.1.3 線性考察 稱取PF 對照品（含量≥98%）適量置于10 mL 容量瓶中，使用甲醇定容，母液濃度為2 720.48 μg/mL。將母液濃度依次配置為1 360.24、544.10、272.05、136.02、54.41、13.60 μg/mL，以PF 濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=13.527C+82.105，R2=0.999 5。

2.1.4 精密度考察 取“2.1.3”項(xiàng)下濃度分別為54.41、136.02、1 360.24 μg/mL 的低、中、高濃度的供試品溶液，1 d 內(nèi)分別測定3 次，連續(xù)測定3 d，根據(jù)供試品溶液的峰面積，計(jì)算3 種濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液日內(nèi)精密度RSD 范圍為0.15%～2.57%，日間精密度范圍為1.92%～2.53%。

2.1.5 重復(fù)性考察 取12 h 內(nèi)的同一PF 凝膠透皮接受液，離心（10 000r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 濾膜，平行處理6 份，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算RSD 值為1.02%。

2.1.6 加樣回收率 取已知含量的PF 凝膠透皮接受液，平行處理6 份，分別加入PF 對照品2.46 mg，進(jìn)樣分析，計(jì)算6 份接受液加樣回收率平均值為99.41%，RSD 值為0.76%。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取12 h 內(nèi)的同一PF 凝膠透皮接受液，離心（10 000r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 濾膜，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 進(jìn)樣檢測，以各樣品中PF 的含量計(jì)算RSD 值為0.51%。

2.2 PF 理化性質(zhì)測定

東北四省區(qū)節(jié)水增糧行動是中央著眼經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展全局批準(zhǔn)開展的一項(xiàng)重大專項(xiàng)行動。東北四省區(qū)水資源相對短缺，特別是農(nóng)業(yè)發(fā)展受到水資源條件制約，開展東北四省區(qū)節(jié)水增糧行動水資源論證是實(shí)施好節(jié)水增糧行動的重要前期工作，對科學(xué)確定發(fā)展規(guī)模，合理利用有限水資源，緩解水資源供需矛盾，提高水資源利用效率，確保節(jié)水增糧增效具有重要意義。項(xiàng)目水資源論證過程中，切實(shí)加強(qiáng)工作領(lǐng)導(dǎo)，進(jìn)一步提高認(rèn)識，統(tǒng)一思想，通過主要領(lǐng)導(dǎo)親自抓、勤過問、多了解、常督促，將最嚴(yán)格水資源管理制度的總體要求嚴(yán)格落實(shí)到報(bào)告書編制過程中，才能真正做到科學(xué)論證確定項(xiàng)目發(fā)展規(guī)模，合理利用有限的水資源，進(jìn)而做到量水而行、因水制宜，通過節(jié)水實(shí)現(xiàn)增糧。

2.2.1 PF 表觀溶解度的測定 將過量的PF 原料藥加入至pH 為7.4 的2 mL 磷酸緩沖鹽溶液中（n=3），使用智能磁力加熱攪拌器攪拌24 h，溫度控制在（37±1）℃，制成過飽和溶液，靜置，吸取上清藥液使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，離心（10 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），取0.1 mL 加至50 mL 容量瓶中，使用pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行稀釋、定容，按照“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算PF在pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液中的溶解度為（118.00±0.48）mg/mL。

2.2.2 PF 油水分配系數(shù)測定 精密量取上述離心后的PF 飽和溶液1 mL 置于4 mL 離心管中，加等量的水飽和正辛醇恒溫振蕩2 h，靜置24 h 分層，精密量取下層水溶液0.1 mL，加入pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液稀釋至50 mL，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，用HPLC 法測定水相中PF 含量，根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算，PF 在pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中的油水分配系數(shù)LogP=-0.59。

Co 為PF 在油相（即正辛醇）中的濃度，Cw 為PF 在水相中的濃度。

2.3 PF 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.3.1 離體大鼠皮膚處理 取健康SD 雄性大鼠，剔除腹部皮膚絨毛，以10%水合氯醛（0.8 mL/只）麻醉大鼠，使用剪刀小心剝離腹部皮膚，并用刀片剔除皮膚組織及脂肪，過程中不得破損皮膚。用生理鹽水反復(fù)沖洗后，平鋪于鋁箔紙上，包好，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩４娣挪坏贸^7 d，實(shí)驗(yàn)時室溫下自然解凍。

2.3.2 含不同促滲劑PF 凝膠劑的制備 稱取0.4 g卡波姆940 于100 mL 燒杯中，加入適量去離子水，使用磁力攪拌器攪拌均勻，溶脹過夜后加入處方量的PF 原料藥，加入甘油10 g，分別加入不含和含有促滲劑薄荷油（3%、5%、7%、9%）、油酸（2%、3%、4%）、氮酮（3%、4%、5%）、桉葉油（3%、4%、5%），攪拌均勻，加入去離子水至100 g，加入處方量的羥苯乙酯，攪拌，加入處方量的三乙醇胺，充分?jǐn)嚢杈鶆颍x心（4 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），去除氣泡即得。

2.3.3 經(jīng)皮滲透動力學(xué)方程及其動力學(xué)參數(shù)考察 使用改良后的Franz 垂直擴(kuò)散池，擴(kuò)散池分為供給池和接收池兩個部分，接收池體積為8 mL，擴(kuò)散池有效透皮面積為3.14 cm2。分別取1.0 g 凝膠于透皮擴(kuò)散池供給池上，使之與大鼠皮膚充分接觸。接受池中注入pH 為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液8 mL，排空氣泡，將透皮擴(kuò)散儀水浴溫度控制在（37±1）℃，磁力攪拌（500 r/min）。分別于給予凝膠后1、2、4、6、8、10、12 h 從接收池中取2.0 mL 接收液，同時補(bǔ)充等體積相同溫度的空白接收介質(zhì)，將取出的接收液離心（13 000 r/min，10 min，離心半徑16.8 cm），過水系0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定并計(jì)算各時間點(diǎn)接收液中藥物的濃度（Cn）、單位面積藥物累積透皮量（Qn）和藥物累積透皮率（Fn）。按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中Cn、Ci為第n 個和第i 個取樣點(diǎn)測得的藥物濃度，V0為接收池中接收液的體積，Vi為每次取樣的體積，A為有效透皮面積，Q總為供給池凝膠中的PF 總含量，Ps 為表觀滲透系數(shù)。以單位時間（t）對Qn作圖，可得到藥物累積釋放曲線，進(jìn)行線性回歸得到擬合方程，其斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（Js）。

2.4 不同促滲劑對PF 透皮吸收的影響 本研究使用不同比例的薄荷油、油酸、氮酮和桉葉油作為促滲劑，以12 h 時的Q值、Js、Ps 及增滲比為考察指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1 不同促滲劑在不同濃度下的經(jīng)皮滲透動力學(xué)方程及其動力學(xué)參數(shù)

由表1 可知，PF 的經(jīng)皮滲透動力學(xué)符合零級動力學(xué)方程，不同時刻累積滲透量與時間具有良好的線性關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方面，以Js 為考察指標(biāo)，進(jìn)行t檢驗(yàn)。圖2 為采用4 種不同促滲劑時PF 凝膠的藥物累積滲透曲線。圖2A 可以看出，薄荷油由低濃度3%到7%時，PF 累積透過量呈增加趨勢，當(dāng)在7%濃度時，12 h 的PF 經(jīng)皮累積透過量達(dá)到最高值，當(dāng)薄荷油濃度繼續(xù)增加到9%時，PF 12 h 累積透過量降低，說明薄荷油作為促滲劑具有一個最佳濃度，比此濃度高或低的促滲劑促滲作用不理想，甚至?xí)F 的經(jīng)皮滲透產(chǎn)生抑制作用。與空白促滲劑比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是5%薄荷油與7%薄荷油（P＜0.01），分別使PF 經(jīng)皮速率提高至1.63、1.95倍。在7%薄荷油作用下，PF 6 h 累積透過率為60.50%，12 h 累積透過率為81.20%；而未添加促滲劑時，PF 6 h 累積透過率為13.70%，12 h 累積透過率為33.80%，即7%薄荷油可以提高PF 累積透過率。通過圖2B 及圖2D 可以看出，當(dāng)分別提高油酸和桉葉油濃度時，PF 累積透過量均是先升高后降低，但只有3%油酸及4%桉葉油對PF 具有促滲作用，與空白促滲劑比較，這兩種促滲劑透皮速率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），分別使PF 經(jīng)皮速率提高至1.19、1.20 倍。圖2C 考察氮酮最常用的促滲濃度，未發(fā)現(xiàn)其對PF 具有促滲作用。通過表1 可知，這幾種促滲劑對PF 促滲作用依次為7%薄荷油＞5%薄荷油＞4%桉葉油＞3%油酸。

圖2 不同促滲劑中PF 累積透過曲線圖

3 討論

一般來講，藥物的溶解度、油水分配系數(shù)、相對分子質(zhì)量等對其經(jīng)皮吸收能力起決定性作用，由“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下的考察結(jié)果可知，PF 在pH為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液中的溶解度為（118.00±0.48）mg/mL，表明PF 是一種強(qiáng)水溶性藥物，過高的水溶性藥物或脂溶性藥物均不利于制成外用制劑。通常logP值范圍在2～3 的藥物具有較好的經(jīng)皮滲透效果[14]，PF 的logP值為-0.59，數(shù)值較小，PF 相對分子質(zhì)量為480.462，分子質(zhì)量小于500，有利于通過皮膚障礙，但由于logP值較小，與皮膚的相容性較差，導(dǎo)致其不易透過角質(zhì)層。因此篩選合適的促滲劑，提高PF 累積透過量，增加藥物吸收率顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15-17]，選擇對薄荷油、桉葉油、油酸及氮酮4 種常用促滲劑進(jìn)行考察。參照文獻(xiàn)，桉葉油、油酸和氮酮促滲劑常用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5%，本實(shí)驗(yàn)主要選取這一范圍進(jìn)行考察。

透皮結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白促滲劑比較，在4%桉葉油及3%油酸作用下，這兩種促滲劑均有促滲效果，透皮速率提高（P＜0.05），在其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)下呈現(xiàn)抑制作用。桉葉油對水溶性藥物及脂溶性藥物均具有促進(jìn)滲透作用，機(jī)制可能為桉葉油作用于皮膚類脂間質(zhì)，使其結(jié)構(gòu)遭到破壞，通透性增加，從而促進(jìn)藥物的透皮吸收[18]。油酸在低濃度時對水溶性藥物具有促進(jìn)滲透作用[19]，機(jī)制可能是其對皮膚的整個角質(zhì)層中的脂質(zhì)作用，使脂質(zhì)流動性增強(qiáng)，減少藥物透過時的阻力[20]。氮酮作為最常用的促滲劑，一般促滲效果較好，本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)氮酮對PF 的經(jīng)皮產(chǎn)生促滲作用，3 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氮酮均對PF 表現(xiàn)出抑制作用（增滲比＜1），可能是因?yàn)樘岣叩|(zhì)量分?jǐn)?shù)會增加凝膠的黏稠性，因此呈現(xiàn)出抑制作用。既往研究結(jié)果表明，薄荷油對水溶性藥物具有較好的促滲透作用[21-23]，且薄荷油濃度較高時，促滲效果較強(qiáng)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)薄荷油濃度為5%時，透皮速率提高（P＜0.01）；當(dāng)薄荷油濃度為7%時，促滲效果最強(qiáng)。但當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，反而不利于PF滲透。薄荷油的促滲機(jī)制可能是通過破壞角質(zhì)層間質(zhì)，從而引起細(xì)胞間隙增加，降低了PF 通過角質(zhì)層的阻力[24]。

本研究最終選擇7%薄荷油作為PF 凝膠促滲劑，可為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎開發(fā)新藥提供依據(jù)。