甘草地上部分活性部位的急性毒性和長期毒性實驗研究*

劉海帆，冀祖恩，彭一峰，張麗，孫琰琴，羅恒磊，張薇

（1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2.新疆甘草及制品研究重點實驗室，庫爾勒 841011；3.新疆全安藥業股份有限公司，庫爾勒 841011）

甘草地上部分為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）的干燥莖葉，其資源豐富且總黃酮含量可達5.64%[1]。課題組前期研究表明甘草地上部分醇提物具有抗慢性非細菌性前列腺炎（CNP）的作用[2]，且黃酮類成分為其主要活性成分[3]。本研究對甘草地上部分醇提物進一步富集黃酮后得到的活性部位進行急性毒性和長期毒性實驗，為甘草地上部分活性部位在臨床上的安全應用提供合理的科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BC-2800vet 邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀（深圳雷杜生命科技）；Chemray800 全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；ME203E/02 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；D3024R 臺式高速冷凍離心機（大龍興創實驗儀器北京股份公司）；MX-F 渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；EP-150-M 1.5 mL 離心管（武漢賽維爾生物科技有限公司）；KE0037273 1 000 μL 移液器、YE3K030591 200 μL 移液器、DS35110 50 μL移液器、KE0012951 10 μL 移液器（移液器均購自大龍興創實驗儀器北京股份公司）；1012710P 載玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；Sw101-35 烤箱（上海蘇博儀器有限公司）；10212450C 蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；EG11 組織包埋機（德國徠卡）；SYD-PK 切片烤片機（沈陽譽德電子儀器有限公司）；RM2245 切片機（德國徠卡）。

1.2 藥物與試劑 本實驗樣品甘草地上部分是采自甘肅省酒泉市瓜州縣河東鄉的9年生栽培甘草，經中國醫學科學院王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.，經自然陰干后，粉碎過40 目篩，備用。甘草地上部分以70%乙醇回流提取，提取溫度75 ℃，液料比8∶1，提取時間90 min，提取2 次，濃縮、干燥成粉末。將甘草地上部分醇提物用10 倍量的去離子水溶解后靜置12 h，3 500 r/min 離心15 min（離心直徑為80 cm）得到上清，將上清溶液部分揮干，收集得到的上清浸膏為甘草地上部分活性部位，即本研究的受試物（出膏率為79.3%，黃酮含量為14.58%），受試物的制備方法依據本課題組前期研究得到的最佳醇提工藝[4]進行微調；水（娃哈哈集團有限公司）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，coolaber 公司）；二甲苯（北京化工廠）；中性樹膠（上海實驗器材廠）；蘇木素染液（珠海貝素生物技術公司）；伊紅染液（珠海貝素生物技術公司）；S03030 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、S03040 天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、S03038 堿性磷酸酶、S03043 白蛋白、S03022 總蛋白、S03036 尿素、S03076 肌酐、S03024 肌酸激酶、S03027 三酰甘油、S03042 總膽固醇、S03039 葡萄糖測定試劑盒（深圳市雷杜生命科學股份有限公司）；C120 總膽紅素、C108 鈉、C013 氯、C068 鉀測定試劑盒（長春匯力生物技術有限公司）。

1.3 動物 SPF 級昆明種雄性小鼠20 只，體質量45～50 g（用于急性毒性實驗）；SPF 級SD 雄性大鼠40 只，體質量180～200 g（用于長期毒性實驗），均購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物常規飼養，保持恒溫24 ℃，12 h 光/暗周期下，接受標準飲食和水，自由采食。本研究經中國醫學科學院藥用植物研究所動物福利倫理委員會批準，符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則，急性毒性實驗小鼠與長期毒性實驗大鼠的倫理審查編號分別為SCXK（京）2016-0006、SLXD（京）-20200902021。

2 方法

2.1 急性毒性實驗 選取SPF 級昆明種雄性小鼠20 只，分為2 組，分別為實驗組和空白組，每組10 只。實驗組劑量為33.2 g/kg（最大給藥劑量），灌胃給藥，兩組均每日給藥2 次（間隔5 h），空白組給予等體積0.5%CMC-Na 溶液。給藥后連續觀察4～6 h，以后每日觀察1 次，持續觀察14 d。觀察小鼠的基本狀況（是否腹瀉、驚厥、嗜睡，是否出現被毛、皮膚、呼吸系統等異常），第14 天處死所有小鼠，進行解剖觀察是否有臟器病變，實驗期間的第0、7、11、14 天記錄小鼠體質量。

2.2 長期毒性實驗 選取SD 雄性大鼠40 只，分為空白組、受試物8.3、16.6、33.2 g/kg 組，每組10 只，每日給藥1 次，每周連續給藥6 d，停藥1 d，共連續給藥90 d，空白組給予等體積0.5%CMC-Na 溶液。每日觀察動物精神狀態、行為活動、毛色、二便等一般體征，每周稱取體質量1 次，根據體質量變化及時調整灌胃量，2 d 記錄1 次大鼠飲水量與攝食量，計算食物利用率（食物利用率=體質量增加量÷進食量×100%，表示大鼠攝入100 g 飼料增加的體質量）。給藥中期（45 d）及末期（90 d）禁食不禁水16 h，麻醉后眼眶取血，制備全血及血清標本，分別進行血液學及血清生化指標檢測；實驗結束后解剖取出臟器并稱取質量，計算臟器指數，對臟器進行組織病理學檢查。

2.3 數據統計與處理 采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，對滿足正態性分布及方差齊性的數據，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 急性毒性實驗

3.1.1 小鼠死亡與生存狀況分析 在灌服甘草地上部分活性部位后，各組均未出現小鼠死亡情況，未發現腹瀉、嗜睡、驚厥等行為，未發現被毛、皮膚等異常，實驗組與空白組小鼠狀態無明顯差異。

3.1.2 小鼠體質量與大體解剖情況分析 各組小鼠平均體質量呈增長趨勢，且實驗組與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。第14 天解剖小鼠后，兩組均未發現明顯臟器病變。見表1。

表1 甘草地上部分活性部位對小鼠體質量的影響（±s）g

表1 甘草地上部分活性部位對小鼠體質量的影響（±s）g

組別 動物數第0 天第7 天第11 天第14 天空白組1046.40±2.42 50.80±1.60 51.00±1.48 54.40±1.96實驗組1048.60±1.11 51.60±1.56 52.50±1.75 53.20±1.89

3.2 長期毒性實驗

3.2.1 大鼠死亡與生存狀況分析 實驗過程中，各組大鼠身體狀況良好，飲水與進食正常，體質量呈增長趨勢，大小便正常，全程未見實驗動物死亡情況。

3.2.1.1 甘草地上部分活性部位對大鼠體質量的影響 各實驗組與空白組大鼠體質量均呈增長趨勢，第1 周增長較快，各劑量組及空白組動物體質量均未發現異常變化。見表2。

表2 甘草地上部分活性部位對大鼠體質量的影響（±s）g

表2 甘草地上部分活性部位對大鼠體質量的影響（±s）g

組別動物數第1 周第2 周第3 周第4 周第5 周第6 周空白組10314.23±10.73361.34±21.09406.15±24.99443.88±27.77461.38±25.18484.55±22.34 8.3 g/kg 組10317.39±15.63362.67±21.71412.00±30.25452.47±37.02460.79±47.06480.51±51.58 16.6 g/kg 組10310.31±14.05351.36±24.64390.09±24.45430.01±30.70447.27±34.19469.67±35.36 33.2 g/kg 組10308.50±16.19351.36±23.11388.03±28.38426.30±33.70445.71±37.78466.34±43.98組別動物數第7 周第8 周第9 周第10 周第11 周第12 周空白組10510.58±26.94535.22±26.92554.93±25.49575.75±25.65592.00±25.07601.25±31.04 8.3 g/kg 組10508.61±59.03527.45±67.67565.17±53.38587.62±58.22583.93±54.3638.00±64.22 16.6 g/kg 組10486.67±47.41513.35±37.92542.13±39.48565.31±38.21587.01±36.28598.14±36.12 33.2 g/kg 組10492.63±47.35518.81±44.92546.59±50.09566.01±53.56590.04±57.98606.80±59.78

3.2.1.2 甘草地上部分活性部位對大鼠食物利用率的影響 各組大鼠在90 d 實驗周期內的食物利用率趨勢一致，均呈現降低的趨勢，在同一時間節點，各實驗組與對照組大鼠食物利用率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），認為甘草地上部分經口給藥90 d 對大鼠的正常進食無不良影響。各組大鼠的食物利用率隨時間變化情況見表3。

表3 甘草地上部分活性部位對大鼠食物利用率的影響（±s）%

表3 甘草地上部分活性部位對大鼠食物利用率的影響（±s）%

組別動物數 第1 周 第2 周 第3 周 第4 周 第5 周 第6 周 第7 周 第8 周 第9 周 第10 周 第11 周 第12 周空白組1031±230±416±614±213±212±216±315±312±312±48±1.01±0.3 8.3 g/kg 組1039±521±428±523±38±110±314±515±314±411±17±1.53±0.8 16.6 g/kg 組1043±425±329±623±216±221±49±217±218±112±29±1.71±0.2 33.2 g/kg 組1043±526±630±422±212±312±214±119±620±110±111±2.01±0.2

3.2.1.3 甘草地上部分活性部位對大鼠飲水量的影響 空白組與各實驗組在90 d 實驗周期內的飲水量變化趨勢基本一致，第10 周時均出現下降趨勢，在第11 周恢復，可能是由于第10 周時受環境因素影響，動物房溫度升高或者環境出現異常所致。但各給藥組與空白組趨勢一致，所以認為甘草地上部分活性部位經口給藥90 d 對大鼠的正常飲水無不良影響。各組大鼠的飲水量隨時間變化情況見表4。

表4 甘草地上部分活性部位對大鼠飲水量的影響（±s）g

表4 甘草地上部分活性部位對大鼠飲水量的影響（±s）g

組別動物數 第1 周第2 周第3 周第4 周第5 周第6 周第7 周第8 周第9 周第10 周第11 周第12 周空白組1056.00±3.64 54.17±6.24 65.63±9.51 52.29±5.36 52.32±4.69 51.46±5.46 38.75±5.41 42.93±4.16 46.25±6.54 27.37±6.28 37.96±4.82 36.25±7.46 8.3 g/kg 組1056.17±5.84 64.00±6.91 54.11±6.24 68.10±8.91 62.86±6.39 61.67±5.91 58.57±9.81 72.53±9.82 70.83±10.19 39.77±4.82 50.78±5.49 53.72±4.10 16.6 g/kg 組1051.20±3.26 67.02±5.91 50.71±3.56 55.83±8.51 50.92±5.96 50.00±6.81 51.29±3.61 56.02±4.92 46.50±4.92 36.35±5.61 38.24±4.19 37.90±4.79 33.2 g/kg 組1045.43±4.39 51.55±8.64 44.38±5.26 48.10±4.69 44.80±4.62 42.74±4.92 42.14±7.91 53.79±5.08 51.57±8.19 37.71±4.00 35.65±2.79 37.81±8.21

3.2.2 大鼠臟器及組織病理學分析

3.2.2.1 大體解剖觀察 與空白組比較，各實驗組大鼠大體解剖和臟器與體質量比例結果未見明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。主要指標見表5。

表5 甘草地上部分經口給予90 d 對大鼠臟器指數的影響（±s）%

表5 甘草地上部分經口給予90 d 對大鼠臟器指數的影響（±s）%

組別空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組動物數10 10 10 10胸腺指數心臟指數 肺臟指數 脾臟指數 腎上腺指數 腎臟指數 附睪指數 睪丸指數前列腺指數肝臟指數 腦指數0.000 66±0.000 17 0.23±0.004 0.30±0.02 0.17±0.009 0.011±0.001 0.64±0.06 0.22±0.06 0.72±0.04 0.13±0.03 2.90±0.25 0.39±0.01 0.000 65±0.000 19 0.24±0.050 0.26±0.07 0.17±0.040 0.009±0.002 0.67±0.15 0.25±0.04 0.64±0.09 0.12±0.04 3.20±0.82 0.36±0.07 0.000 57±0.000 21 0.23±0.030 0.27±0.03 0.16±0.030 0.023±0.037 0.59±0.09 0.27±0.04 0.68±0.08 0.12±0.03 2.72±0.50 0.35±0.04 0.000 52±0.000 15 0.25±0.040 0.31±0.04 0.18±0.030 0.012±0.003 0.66±0.08 0.23±0.04 0.63±0.09 0.12±0.04 3.01±0.43 0.35±0.05

3.2.2.2 組織病理學檢查 各實驗組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、腎上腺、附睪、睪丸、前列腺、腦組織結構清晰，形態完整，未見明顯病理改變。蘇木精-伊紅（HE）染色結果見圖1。

圖1 大鼠組織病理學HE 染色結果（×400）

心肌細胞排列正常，形態結構無紊亂；肝臟組織病理切片可見肝小葉結構完整，肝細胞及血竇清晰無異常，肝竇未見充血，肝匯管內無明顯炎性細胞浸潤；脾臟組織切片中紅髓區和白髓區界限清晰，小梁結構無異常；肺泡組織形態、結構清晰，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，肺泡囊管壁結構完整；腎小體結構完整，腎小球位于小體中央且結構完整；胸腺皮髓界限清楚，小葉明顯，皮質部成熟淋巴細胞較多，髓質部可見明顯的胸腺小體；腎上腺皮質與髓質分界明顯；皮質部網狀帶、球狀帶、束狀帶的細胞結構正常；附睪細胞排列緊密，界限清晰，附睪管內含有大量成熟精子；睪丸曲細小管內各級生精細胞發育良好；前列腺體未見萎縮，間質無水腫，無炎癥細胞浸潤，腺泡上皮排列整齊無增生現象；腦組織結構正常，皮質結構清晰，神經細胞結構完整，無炎性細胞浸潤，白質部神經纖維染色均勻，為淡粉色，排列整齊，紋理清晰。

3.2.3 甘草地上部分活性部位對大鼠血液學指標的影響

3.2.3.1 實驗45 d 血液學檢測結果 實驗45 d 時，與空白組比較，部分實驗組的檢測指標出現變化，差異有統計學意義（P＜0.05），其中8.3 g/kg 組的白細胞計數、單核細胞數目、中性粒細胞數、血小板計數以及16.6 g/kg 組的血小板計數降低。實驗45 d時各組大鼠的血液學指標見表6。

表6 甘草地上部分活性部位經口給予45 d 對大鼠血液學指標的影響（±s）

表6 甘草地上部分活性部位經口給予45 d 對大鼠血液學指標的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

白細胞檢測紅細胞檢測組別動物數白細胞計數（×109/L）淋巴細胞數（×109/L）單核細胞數（×109/L）中性粒細胞數（×109/L）淋巴細胞百分比（%）單核細胞百分比（%）中性粒細胞百分比（%）紅細胞計數（×1012/L）血紅蛋白（g/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 13.85±1.6311.68±1.460.30±0.001.88±0.3384.23±2.032.23±0.2913.55±1.807.21±0.14 138.75± 3.70 10.07±0.61*8.87±0.530.15±0.05*1.05±0.22*87.97±2.011.83±0.2710.20±1.936.79±0.92 135.67± 9.64 11.63±2.6710.08±2.140.22±0.091.33±0.5486.95±2.722.00±0.2911.05±2.476.62±1.30 135.67±13.56 10.50±2.759.10±2.400.23±0.091.17±0.3486.80±1.062.15±0.8711.05±0.626.60±1.81 127.00± 8.49紅細胞檢測血小板檢測組別動物數平均紅細胞體積（fL）紅細胞壓積（%）43.20±0.83 40.68±4.48 41.37±7.10 39.94±9.07平均紅細胞血紅蛋白量（pg）平均紅細胞血紅蛋白濃度（g/L）紅細胞分布寬度（%）血小板計數（×109/L）平均血小板體積（fL）血小板分布寬度（%）血小板壓積（%）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 60.03±1.0819.23±0.28 60.32±3.4220.20±2.15 62.98±3.3220.95±2.74 62.45±5.3618.88±1.05 245.50±30.49 335.00±23.76 282.67±21.36 367.60±99.29 15.25±0.54 16.03±0.37 15.83±0.46 16.08±0.43 1 184.25±827.00 741.80± 96.65*691.33±168.01*849.60±119.19 6.15±0.32 6.83±0.63 6.57±0.37 6.38±0.63 16.78±0.77 18.47±1.04 18.25±0.79 17.88±1.31 0.66±0.04 0.46±0.16 0.45±0.11 0.49±0.15

3.2.3.2 實驗90 d 血液學檢測結果 實驗90 d 時，與空白組比較，各實驗組指標未見明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗90 d 時各組大鼠血液學指標見表7。

表7 甘草地上部分活性部位經口給予90 d 對大鼠血液學指標的影響（±s）

表7 甘草地上部分活性部位經口給予90 d 對大鼠血液學指標的影響（±s）

白細胞檢測紅細胞檢測組別動物數白細胞計數（×109/L）淋巴細胞數（×109/L）單核細胞數（×109/L）中性粒細胞數（×109/L）淋巴細胞百分比（%）單核細胞百分比（%）中性粒細胞百分比（%）紅細胞計數（×1012/L）血紅蛋白（g/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 13.15±2.1511.20±2.060.30±0.071.65±0.2384.80±2.812.30±0.3212.90±2.508.46±0.30 152.25±3.96 9.72±4.408.85±2.740.15±0.051.30±1.1384.83±4.842.15±0.7413.02±1.147.27±1.55 128.67±2.67 12.70±2.0810.38±1.750.32±0.072.00±0.3081.80±1.092.58±0.2115.62±1.048.30±0.45 153.83±5.58 11.80±1.079.85±1.010.28±0.041.67±0.2783.53±2.232.25±0.3714.22±1.968.28±0.31 151.83±2.61紅細胞檢測血小板檢測組別動物數平均紅細胞體積（fL）平均紅細胞血紅蛋白量（pg）平均紅細胞血紅蛋白濃度（g/L）紅細胞分布寬度（%）紅細胞壓積（%）47.90±1.00 39.40±8.70 46.38±1.88 45.57±1.35血小板計數（×109/L）平均血小板體積（fL）血小板分布寬度（%）血小板壓積（%）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10 56.80±2.0317.98±0.55 54.17±1.8617.65±0.54 55.98±1.8518.52±0.62 55.15±1.4418.32±0.52 317.25±6.22 327.17±8.17 331.17±3.34 332.83±5.58 14.40±0.83 13.73±0.85 13.95±1.06 13.95±0.50 967.70±139.65 914.00±292.94 800.17±118.28 782.67±195.10 6.35±0.15 6.28±0.42 6.47±0.44 6.37±0.24 16.50±0.07 17.13±0.41 16.65±0.28 16.60±0.32 0.57±0.06 0.51±0.14 0.51±0.07 0.49±0.11

實驗45 d 時，8.3g/kg 組的白細胞計數、單核細胞數、中性粒細胞數、血小板計數及16.6 g/kg 組的血小板計數與空白組比較顯著降低，而實驗90 d 時檢測卻未見顯著性差異，考慮為采集時間、方法與個體差異所致。由于實驗45 d 時采用大鼠眼眶后靜脈叢采血的方式采集血液，而實驗90 d 時采用腹主動脈采血方式，所以推測眼眶后靜脈叢采血會造成動物產生興奮與排尿、排便等現象，從而影響部分血液學、生化指標改變[5]，且由于實驗45 d 與90 d采血時間相差45 d，有研究表明不同年齡大鼠的血液學指標會有所不同[6]。

上述結果中有較多的血液學檢測指標異常，但根據毒理學實驗的評價標準可知，血液學檢測指標均存在正常范圍，即使各實驗組的實際檢測值與空白組比較有統計學差異，但若這個數值在正常范圍之內，則這個數值依然為正常值。或者部分指標只有異常升高時才具有臨床意義，異常降低則不作為診斷標準，此時也不認為是發生毒性反應。按照此原則[7]對數據進行分析后，排除了無意義的異常值，最終提示甘草地上部分活性部位給藥后實驗45 d與實驗90 d 對大鼠血液學檢測指標并無異常影響。

3.2.4 甘草地上部分活性部位對大鼠血清生化指標的影響

3.2.4.1 實驗45 d 大鼠血清生化檢測結果 實驗45 d 時，與空白組比較，8.3 g/kg 組白蛋白異常降低，16.6 g/kg 組白蛋白、鈉離子異常降低，葡萄糖異常升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗45 d 時各組大鼠血清生化指標見表8。

表8 甘草地上部分活性部位經口給予45 d 對大鼠血清生化指標的影響（±s）

表8 甘草地上部分活性部位經口給予45 d 對大鼠血清生化指標的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別動物數空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10肝功能腎功能白蛋白（g/L）堿性磷酸酶（U/L） 總膽紅素（μmol/L）總蛋白（g/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）37.72±1.55136.36±30.309.76±1.3456.26±3.7715.05±0.8932.02±2.30 35.77±0.88*172.64±24.938.46±3.0554.36±1.7213.51±1.9830.27±0.98 35.29±0.34*130.97±25.278.90±2.0053.76±1.8414.14±1.0432.04±3.94 36.51±0.80152.05±22.058.38±2.5154.74±1.7113.06±2.5631.51±2.42組別動物數血糖葡萄糖（mmol/L）心肌酶肌酸激酶（U/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10血脂離子三酰甘油（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）氯（mmol/L） 鉀（mmol/L） 鈉（mmol/L）1.19±0.221.92±0.276.75±0.43779.80± 61.33101.15±1.852.89±0.04158.68±0.85 1.03±0.301.79±0.217.47±1.02859.74± 86.97110.19±6.142.93±0.14159.71±2.91 1.30±0.311.64±0.157.78±1.64*947.54±180.39117.97±3.702.87±0.16148.54±6.53*0.99±0.341.91±0.219.37±1.11992.15±142.00101.40±2.042.82±0.12159.43±1.24

3.2.4.2 實驗90 d 大鼠血清生化檢測結果 實驗90 d 時，與空白組比較，各實驗組大鼠的總膽紅素均顯著降低；8.3、16.6 g/kg 組三酰甘油均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗90 d 時各組大鼠的血清生化指標見表9。

表9 甘草地上部分活性部位經口給予90 d 對大鼠血清生化的影響（±s）

表9 甘草地上部分活性部位經口給予90 d 對大鼠血清生化的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組動物數10 10 10 10肝功能腎功能白蛋白（g/L）堿性磷酸酶（U/L）總膽紅素（μmol/L）總蛋白（g/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）43.11±1.07215.11±42.2926.60±4.4873.65±4.5515.37±0.6434.61±2.80 42.07±0.55204.18±18.8719.62±3.36*70.77±1.4916.39±1.5538.37±2.74 41.84±0.99217.98±32.8714.99±3.57*70.86±2.7515.26±1.0836.14±2.52 42.76±0.43195.53± 8.4918.82±3.88*72.21±1.2214.61±0.6833.06±2.43組別動物數血糖葡萄糖（mmol/L）心肌酶肌酸激酶（U/L）空白組8.3 g/kg 組16.6 g/kg 組33.2 g/kg 組10 10 10 10血脂離子三酰甘油（mmol/L） 總膽固醇（mmol/L）氯（mmol/L） 鉀（mmol/L） 鈉（mmol/L）2.88±0.572.42±0.309.11±1.41888.52±233.28 117.95±1.453.70±0.19159.85±1.77 1.85±0.87*2.16±0.3410.51±2.11736.79±229.82 114.94±3.283.63±0.36161.37±4.02 1.98±0.51*2.20±0.298.87±1.941 089.58±441.53 113.49±2.003.52±0.10160.34±2.75 2.21±0.612.36±0.318.31±0.691 316.98±441.43 114.44±1.943.68±0.20158.88±2.29

實驗45 d 時，與空白組比較，8.3 g/kg 組大鼠白蛋白異常降低，16.6 g/kg 組大鼠白蛋白、鈉離子異常降低，葡萄糖異常升高。實驗90 d 時，與空白組比較，各給藥組的總膽紅素均顯著降低；8.3、16.6 g/kg 組三酰甘油均顯著降低。這些指標僅45 d 或90 d 時有統計學差異，但均在正常范圍之內，所以認為其屬于無意義的異常值。推測這些值的波動與取樣時間有關，且在90 d 取材前1 d 將大鼠轉移至另一房間，禁食1 個晚上，可能由于環境的變化導致大鼠的某些生化指標產生波動。

血清生化指標同血液學指標一樣，與空白組比較出現統計學差異不完全代表毒性作用，與血液學指標的分析結果相同。以此原則[8-9]對本次實驗的結果進行分析，排除了無意義的異常值，最終提示甘草地上部分活性部位給藥對大鼠血清生化指標無異常影響。

4 討論與結論

相關研究表明，在關注中藥療效的同時也應重視對其安全性的檢測[10]。本課題組前期研究發現甘草地上部分水提物、醇提物具有潛在毒性[11]，為保證臨床用藥的安全性，本研究按照《中藥新藥研究指南》[12]和《中藥、天然藥物長期毒性研究技術指導原則》[13]的要求對甘草地上部分活性部位的毒性進行評價，為新藥研發提供安全性依據。

本實驗中急性毒性與長期毒性研究均只使用雄性鼠，是由于本課題組研究發現甘草地上部分對前列腺炎治療效果顯著[2]，將此藥用于男性患者，故該研究未對雌性鼠展開實驗。

甘草地上部分活性部位的小鼠急性毒性實驗中，在14 d 的觀察期內，無小鼠死亡，各組小鼠被毛、皮膚、運動、身體健康狀況無異常，無明顯中毒癥狀。實驗期間，小鼠體質量正常增長，甘草地上部分活性部位的最大耐受劑量＞33.2 g/kg，屬于無毒級，提示甘草地上部分活性部位無急性毒性。

長期毒性實驗期間，各組實驗動物正常進食進水，食物利用率及飲水量均未見異常；各組大鼠臟器指數均無明顯差異，認為受試物對臟器指數沒有影響。組織病理學方面，受試物對大鼠組織病理學切片無異常影響，且甘草地上部分對大鼠血液學及血清生化指標無異常影響。因此，甘草地上部分活性部位對大鼠一般生理狀態及肝臟、腎臟功能與臟器組織學均無長期毒性反應。

綜上所述，甘草地上部分活性部位無急性毒性和長期毒性反應，藥物的最大耐受量≥33.2 g/kg，即有效劑量[14]的30 倍；基本安全劑量≥33.2 g/kg，即臨床劑量的30 倍，在治療劑量范圍內用藥安全性高。

血液生理生化指標不僅可以反映動物的生理狀態和健康狀態，還可以評價其生長性能和生產性能，對評價動物的代謝狀況、生理狀態和飼養管理具有重要意義。在實驗中出現了個別指標的波動情況，但均在正常范圍之內，推測其與大鼠的年齡、飼養條件及取樣方法有關。楊林等[15]研究表明不同生理階段的同性小鼠血液生理指標差異顯著；詹純列等[16]研究表明環境因素對小鼠血常規的指標有顯著影響；李罡等[17]經研究發現，由于在研究中所收集的SD 大鼠血液學指標和血清生化指標資料包括了3 個不同實驗室和4 個季節的實驗數據，實驗所用動物的年齡、初始體質量、營養及喂養環境等條件有所差異，血樣的采集、運送和檢測條件等亦不完全一致，使血紅蛋白等10 項指標的測定值在不同批次間差異具有統計學意義（P＜0.05）。

針對受試物的化學成分，本課題組通過網絡藥理學和大鼠體內的入血及代謝成分，得到甘草地上部分醇提物的主要藥效成分為葛根素、山奈酚、木犀草素和喬松素4 種黃酮類成分，并且通過藥代動力學實驗探究了4 種成分在血漿、尿液、糞便及前列腺中的濃度變化，得出這4 種成分在血漿及前列腺中均有分布，之后可以考慮將這4 種成分作為甘草地上部分活性部位的質控成分[3]。

受試物的主要成分為黃酮類成分，他們除了具有相應藥效外，研究還表明其具有臟器保護作用，能夠降低毒性。Yang 等[18]發現甲基化黃酮的表觀滲透系數是非甲基黃酮的4～7 倍，吸收較好。硫酸酯化代謝會增加藥物的水溶性，使其更容易隨尿液排出，降低毒性[19]。侯筱婷[20]研究表明葛根素可以預防大鼠急性酒精性肝損傷，對肝臟具有保護作用。預先給予葛根素可以明顯減輕急性肺損傷大鼠肺組織炎癥反應及肺水腫程度[21]，可有效拮抗慶大霉素所致的大鼠腎損害[22]。香葉木素在肝、肺、腎臟中均有分布，香葉木素可通過降低核苷酸結合寡聚化結構域樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體活性緩解四氯化碳（CCl4）誘導的肝損傷大鼠肝纖維化[23]，對胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷具有治療作用[24]，可以通過核因子E2 相關因子2（Nrf2）抗氧化信號通路緩解順鉑誘導的急性腎損傷[25]。

除了保護作用，黃酮類化合物會影響人體內藥物的代謝，甚至導致不良反應。如其在體內會和細胞色素P450 作用，從而影響體內藥物的濃度，導致藥效減弱或者增強，甚至產生毒性[19]；黃酮類化合物也可能影響親和素蛋白的活性，導致親和素-致癌物的活性增加[26]。研究發現，黃酮類化合物還可以激活CYP1A1 和CYP1A2，從而誘導致癌物質的活化，如高良姜素、槲皮素、香葉木素可以增加CYP1A1 基因的表達[27-28]，在之后的研究中可以對其中特定的黃酮類毒性成分予以關注。