基于NF-κB信號通路探討通管助孕方治療輸卵管阻塞性不孕癥大鼠的作用機制*

李盼盼，高慧，劉玉蘭，扈有芹，吳斯怡，張晴爽

（1.承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，承德 067000；3.滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，滄州 061000）

不孕癥是指育齡夫婦有正常規(guī)律的性生活至少1年以上，男方生殖功能正常，在未采取任何避孕措施的情況下，不能受孕的一類婦科疾病[1]。輸卵管阻塞是不孕癥的首要病因，約占所有不孕因素的45%，且發(fā)病率逐年增加[2]。西醫(yī)認為主要是由于金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、淋球菌、衣原體、支原體等病原體上行感染生殖道導(dǎo)致輸卵管炎[3]，進而引發(fā)炎性因子異常表達是引起輸卵管阻塞性不孕癥的關(guān)鍵因素[4]。通管助孕方是高慧教授臨床長期用于治療本病的經(jīng)驗方，本研究通過采用金黃色葡萄球菌接種法建立輸卵管阻塞性不孕癥大鼠模型，探究通管助孕方對模型大鼠血清和輸卵管中炎性因子[核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、核因子κB 抑制蛋白（IκB）、環(huán)氧合酶2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）]表達的影響，揭示通管助孕方治療本病的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級健康雌性SD 大鼠140 只，體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡10 周；雄性SD 大鼠14 只，體質(zhì)量（220±20）g，鼠齡10 周。均購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于SPF 級實驗室，5 只/籠，室溫18～26 ℃，相對濕度40%～70%，飼養(yǎng)室通風(fēng)干燥，噪音50 dB以下。自然光照條件良好，光明光暗周期各12 h，SPF級維持鼠料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實驗藥品 通管助孕方：皂角刺、穿心蓮、當(dāng)歸、紅花、蒲公英、柴胡、白芍、香附、丹參、青皮、路路通、通草。以上中藥材購自河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥飲片藥房。丹黃祛瘀膠囊（規(guī)格0.4 g/粒，24 粒/盒，吉林龍鑫藥業(yè)有限公司，批號：201109）。人胎盤組織液（2 mL/支，6 支/盒，湖南一格制藥有限公司生產(chǎn)，批號：2021050082）。金黃色葡萄球菌[濃度：3×1012/mL，菌號：CMCC（B）26003，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：G0081DX]。

1.3 藥物制備 中藥通管助孕方：通管助孕方高、中、低劑量組的給藥劑量分別以人與大鼠體表面積的等效劑量換算比例折算為成人等效劑量的1、2、4 倍后[5]，均煎成濃縮劑，分別為含生藥3.654、1.827、0.913 5 g/mL。中藥湯劑制備：將上述中藥放入砂鍋內(nèi)，倒入適量清水以浸沒藥材4 cm 為宜，浸泡0.5 h，先用文火煮沸后改用小火，再熬30 min；用紗布過濾，分離藥液1 和藥渣1，向藥渣1 中添加適量清水，以浸沒藥面3 cm 為宜，小火熬30 min，過濾分離藥液2 和藥渣2；將兩次所熬藥液混合均勻，繼續(xù)蒸煮，濃縮至50 mL 左右，藥液濃度為含生藥3.654 g/mL。將藥液放入容量瓶中，密封保存，置于4 ℃冰箱中冷藏，以供備用。高、中、低藥液濃度比為2∶1∶0.5，同法制備中、低劑量組中藥湯劑。

中成藥組：灌胃丹黃祛瘀膠囊混懸液，按說明書上每人4.8 g/d 計算，按人與大鼠的給藥劑量比例進行換算后，打開膠囊，取膠囊內(nèi)深褐色藥物粉末；用溫開水配成0.050 4 g/mL 的混懸液灌胃給藥。

西藥組：肌肉注射人胎盤組織液，按1 mL/kg 依據(jù)大鼠體質(zhì)量給予相應(yīng)的注射劑量。

1.4 主要試劑 NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法試劑盒（河北貝博實驗用品有限公司，批號202111），TIANScript RT KIT 試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒、Trizol總RNA 提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司，批號分別為：KR109-02、FP208、DP436），NF-κB-p65 一抗、IκBα 一抗、PGE2 一抗、COX-2 一抗（美國Abcam公司，批號分別為：GR3192627-1、GR3193628-1、GR3191618-2、GR3190951-3），辣根過氧化物酶（HRP）羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG，北京中杉金橋，批號：214800903），HRP 羊抗兔IgG（武漢塞維爾生物公司，批號：GB23306），Mayer 蘇木素染色液（上海源葉生物有限公司，批號：Y25N12Y21279），伊紅染色液（上海源葉生物有限公司，批號：Y25N12Y21305），氯仿（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號：YD20200915）。

1.5 主要儀器 光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標分析儀（美國RAYTO 公司），實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（美國BIO-RAD 公司），生物分光光度計（德國Eppendorf 公司），離心機（德國Eppendorf 公司），多功能脫色搖床（美國Thermo 公司），電泳儀、垂直電泳槽及濕轉(zhuǎn)槽（美國BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 動物造模與分組 1）分組：將140 只雌性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組、模型組、中成藥組、西藥組及通管助孕方高、中、低劑量組（通管助孕方高、中、低劑量組以下簡稱高劑量組、中劑量組、低劑量組），每組20 只，共7 組。

2）建立模型：除正常組外，其余各組大鼠均構(gòu)建模型，造模方法借鑒趙廣興等[6]的混合菌接種法與胡喜姣等[7]的金黃色葡萄球菌接種法建立輸卵管阻塞性不孕癥大鼠模型。術(shù)前禁食、水12 h，用10%水合氯醛按0.4 mL/100 g 體質(zhì)量腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉藥物起效后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)剃毛備皮，用酒精消毒；于下腹正中剪開1 個約1 cm 的縱行切口，逐層開腹，輕輕撥開腹腔組織，尋找并暴露Y 行子宮，沿一側(cè)子宮找到輸卵管及卵巢；選取輸卵管作為穿刺點進針，進針位置避開輸卵管與子宮角、卵巢連接處即可，緩慢注入0.05 mL 金黃色葡萄球菌菌懸液；注射完畢后，用動脈夾夾閉針孔以防菌液流出，污染腹腔；同法處理對側(cè)輸卵管。術(shù)后分層關(guān)腹，縫合切口，消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌墊料。

2.2 給藥方法 正常組自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組與各給藥組均在造模后第7 天（9：00—10：00）開始給藥。通管助孕方高、中、低劑量組分別給予通管助孕湯劑36.54、18.27、9.135 g/（kg·d）生藥量灌胃，中成藥組灌胃丹黃祛瘀膠囊混懸液0.504 g/（kg·d），給藥體積均為1 mL/100 g；模型組灌胃等量生理鹽水；西藥組肌肉注射人胎盤組織液1 mL/（kg·d），每日1 次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 取材 灌胃21 d 后，取材。麻醉大鼠后腹主動脈取血，分裝入離心管，離心后，將血清分裝入EP管內(nèi)，-20 ℃冰箱保存；切取適量雙側(cè)輸卵管放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存；剩余雙側(cè)輸卵管組織放入EP 管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存；分別備用于光鏡、ELISA 法、RT-PCR 法、蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1 肉眼觀察 觀察輸卵管形態(tài)、色澤、彈性的變化，管腔通暢與否，與周圍組織粘連情況，有無增粗或變細，有無充血、腫脹、積液、化膿等病理變化。

2.4.2 光學(xué)顯微鏡觀察 迅速切取新鮮輸卵管放入4%多聚甲醛中固定，24 h 后取出，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察輸卵管組織的病理變化。

2.4.3 ELISA 法檢測血清中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 的水平 按照ELISA 試劑盒說明書，進行測定大鼠血清中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 的含量。1）加樣：設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品加樣50 μL，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，樣品最終稀釋度為5 倍。2）加酶：除空白孔外，每孔加入酶標試劑100 μL。3）溫育：用封板膜封板后37 ℃溫育60 min，然后配液、洗滌。4）顯色：每孔加入顯色劑A、B 各50 μL，37 ℃避光顯色15 min。5）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。6）測定：在酶標儀上，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（A值）。

2.4.4 Western Blot 法檢測輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 蛋白表達 取少量輸卵管組織加入至裂解液中充分裂解，4℃離心10min（12000r/min，離心半徑10 cm），取上清液，采用Bradford 法測定蛋白濃度。將含20 μg 蛋白質(zhì)的樣品與蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合，95 ℃變性10 min，電泳90 min，然后在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下封閉1 h，剪膜，再依次按時加入一抗，NF-κB-p65（1∶50 000）、IκBα（1∶1 000）、COX-2（1∶1 000）、PGE2（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后，HRP 標記二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h。采用增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）試劑盒顯色檢測，將印跡膜置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，利用Imag J 軟件對條帶進行密度分析。

2.4.5 RT-PCR 法檢測輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 基因的表達 采用Trizol 試劑提取輸卵管組織中總RNA，再用TIANScript RT KIT 將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，按照20 μL 體系進行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），RT-PCR 法檢測輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 mRNA 的相對表達量，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。反應(yīng)體系：上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL，每孔加入cDNA 100 ng，加雙蒸水（ddH2O）至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，循環(huán)1 次；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共循環(huán)40 次。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 大鼠生殖功能情況 經(jīng)治療取材后，每組大鼠均剩余10 只，每籠5 只雌性大鼠中放入1 只雄性大鼠合籠，大鼠的動情周期為4～5 d，妊娠周期為19～23 d，以飼養(yǎng)60 d 為限（即12 個動情周期），觀察受孕及產(chǎn)仔情況。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察輸卵管結(jié)構(gòu)變化情況 正常組10 只大鼠輸卵管粗細均勻，管腔光滑，與周圍組織均無粘連，無積水積膿，紅潤有光澤，質(zhì)軟，彈性好。模型組10 只大鼠輸卵管嚴重腫脹變粗，管腔粗糙，與周圍組織均有嚴重粘連，嚴重積水或見積膿，蒼白無光澤，質(zhì)硬，彈性差；提示造模成功。中成藥組10 只大鼠輸卵管腫脹變粗，管腔較粗糙，與周圍組織均有較輕粘連，輕度積水，暗紅少光澤，質(zhì)地較硬，彈性略差。西藥組10 只大鼠輸卵管腫脹變粗，管腔較粗糙，與周圍組織均有較輕粘連，輕度積水，暗紅少光澤，質(zhì)地較硬，彈性略差。高劑量組10 只大鼠輸卵管粗細均勻，管腔光滑，與周圍組織均有輕微粘連，無積水，紅潤有光澤，質(zhì)軟，彈性好。中劑量組10 只大鼠輸卵管略腫脹變粗，管腔稍粗糙，與周圍組織均有輕微粘連，少許積水，淡紅有光澤，質(zhì)略硬，彈性可。低劑量組10 只大鼠輸卵管腫脹變粗，管腔粗糙，與周圍組織均有少許粘連，輕度積水，暗紅少光澤，質(zhì)地較硬，彈性較差。見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管肉眼形態(tài)觀察

3.2 光鏡下輸卵管組織病理改變情況 正常組管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，管腔通暢，纖毛豐富，未見炎性細胞及纖維組織。模型組管壁明顯增厚，結(jié)構(gòu)不清晰；管腔阻塞，粘連狹窄；纖毛凌亂，粘連變粗；大量炎性細胞浸潤，大量纖維結(jié)締組織增生；提示造模成功。中成藥組管壁略增厚，結(jié)構(gòu)基本清晰；管腔較通暢，管腔略細；纖毛分支少，輕度粘連；少量纖維結(jié)締組織增生，少量炎性細胞浸潤。西藥組管壁略增厚，結(jié)構(gòu)基本清晰；管腔較通暢，管腔略細；纖毛分支少，無粘連；少量纖維結(jié)締組織增生，極少量炎性細胞浸潤。高劑量組管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，管腔基本通暢；纖毛分支少，無粘連；較少纖維結(jié)締組織增生，無炎性細胞浸潤。中劑量組管壁略增厚，結(jié)構(gòu)基本清晰；管腔較通暢，管腔略細；纖毛分支少，無粘連；少量炎性細胞浸潤，少量纖維結(jié)締組織增生。低劑量組管壁增厚，結(jié)構(gòu)欠清晰；管腔欠通暢，部分管腔狹窄；纖毛分支較多，粘連較輕；多量炎性細胞浸潤，少量纖維結(jié)締組織增生。見圖2。

圖2 各組大鼠輸卵管組織HE 染色結(jié)果（×400）

3.3 血清中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 水平 與正常組比較，模型組大鼠血清中NF-κB、COX-2、PGE2 水平升高，IκB 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中NFκB、COX-2、PGE2 水平降低，IκB 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與中成藥組及西藥組比較，通管助孕方高劑量組大鼠血清中NF-κB、COX-2、PGE2 水平降低，血清中IκB 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；通管助孕方中、低劑量組大鼠NFκB、COX-2、PGE2 及IκB 水平差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清NF-κB、COX-2、PGE2、IκB含量比較（±s）ng/mL

表2 各組大鼠血清NF-κB、COX-2、PGE2、IκB含量比較（±s）ng/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05；與中成藥組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)NF-κBCOX-2PGE2IκB正常組10 0.185±0.0380.209±0.0390.221±0.0380.351±0.034模型組10 0.321±0.034* 0.346±0.036* 0.356±0.032* 0.214±0.038*西藥組10 0.245±0.039# 0.270±0.040# 0.282±0.040# 0.277±0.039#中成藥組 10 0.271±0.036# 0.296±0.035# 0.307±0.037# 0.262±0.024#高劑量組 10 0.204±0.039#▲△0.231±0.040#▲△0.240±0.040#▲△0.318±0.024#▲△中劑量組 10 0.232±0.024# 0.256±0.022# 0.267±0.023# 0.301±0.035#低劑量組 10 0.288±0.025# 0.313±0.026# 0.321±0.027# 0.234±0.038#

3.4 輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 蛋白表達情況 與正常組比較，模型組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 蛋白表達升高，IκB 蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 蛋白表達降低，IκB 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與中成藥組及西藥組比較，通管助孕方高劑量組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 蛋白表達降低，IκB 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；通管助孕方中、低劑量組大鼠NF-κB、COX-2、PGE2 及IκB 蛋白表達差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3 及圖3。

圖3 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2蛋白的表達

表3 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2、IκB蛋白表達情況（±s）

表3 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2、IκB蛋白表達情況（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05；與中成藥組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)NF-κBCOX-2PGE2IκB正常組5 0.69±0.120.59±0.030.64±0.061.26±0.20模型組5 1.47±0.08* 1.41±0.13* 1.42±0.09* 0.25±0.09*西藥組5 0.85±0.04#0.86±0.04#0.88±0.13#0.92±0.01#中成藥組5 0.90±0.07#1.09±0.16#1.01±0.17#0.64±0.13#高劑量組5 0.70±0.15#▲△ 0.68±0.17#▲△ 0.71±0.15#▲△ 1.14±0.14#▲△中劑量組5 0.79±0.08#0.76±0.24#0.80±0.13#1.07±0.08#低劑量組5 1.28±0.05#1.24±0.14#1.20±0.03#0.60±0.14#

3.5 輸卵管組織中NF-κB、IκB、COX-2、PGE2 基因表達情況 與正常組比較，模型組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 基因表達升高，IκB 基因表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 基因表達降低，IκB 基因表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與中成藥組及西藥組比較，通管助孕方高劑量組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2 的mRNA 表達水平降低，IκB 的mRNA 表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；通管助孕方中、低劑量組大鼠NF-κB、COX-2、PGE2 及IκB 的mRNA 水平差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2、IκB 的mRNA 表達情況（±s）

表4 各組大鼠輸卵管組織中NF-κB、COX-2、PGE2、IκB 的mRNA 表達情況（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05；與中成藥組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù)NF-κBCOX-2PGE2IκB正常組51.044±0.1600.971±0.0701.008±0.0901.013±0.016模型組5 10.918±1.276* 9.626±1.358* 9.724±1.242* 0.305±0.045*西藥組55.258±0.767# 3.942±0.674# 4.112±0.805# 0.507±0.077#中成藥組56.435±0.887# 5.079±0.902# 5.351±0.854# 0.434±0.072#高劑量組52.034±0.632#▲△1.034±0.632#▲△1.233±0.599#▲△0.962±0.036#▲△中劑量組54.361±0.724# 3.143±0.819# 3.201±0.659# 0.612±0.094#低劑量組58.320±0.614# 7.116±0.546# 7.222±0.585# 0.395±0.027#

3.6 通管助孕方對大鼠生殖功能的影響情況

3.6.1 妊娠率 模型組大鼠妊娠率為0%，正常組大鼠妊娠率為100%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，通管助孕方高、中、低劑量組大鼠妊娠率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與中成藥組及西藥組比較，通管助孕方高、中、低劑量組大鼠妊娠率差異不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠受孕情況

3.6.2 產(chǎn)仔數(shù) 與模型組比較，經(jīng)通管助孕方治療后的各組大鼠總產(chǎn)仔數(shù)、平均產(chǎn)仔數(shù)增多，子鼠存活率升高，且子代無畸形。與正常組比較，模型組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)下降（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)升高（P＜0.05）。與中成藥組及西藥組比較，通管助孕方高劑量組大鼠平均產(chǎn)仔數(shù)升高（P＜0.05），中、低劑量組無明顯差異（P＞0.05）。見表6。

表6 各組大鼠產(chǎn)仔數(shù)情況

4 討論

中醫(yī)并無輸卵管阻塞性不孕癥這一病名，相關(guān)論述多見于“全不產(chǎn)”“癥瘕”“斷緒”“求嗣”“絕子”等。西醫(yī)治療本病常采用輸卵管介入再通術(shù)、宮腹腔鏡、輸卵管注藥術(shù)等方法，雖然能夠機械性地松解粘連，疏通管腔，使輸卵管在解剖結(jié)構(gòu)上基本恢復(fù)正常，但不能徹底恢復(fù)輸卵管的功能，且存在經(jīng)濟費用高、創(chuàng)傷性大、復(fù)通率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等問題。中醫(yī)認為本病性質(zhì)多為虛實夾雜，但其根在“瘀”，故其治療以活血通脈、消癥散結(jié)為主，以抗炎抗粘連、疏通管腔為輔，促進輸卵管功能恢復(fù)，且治療后不易再粘連，從而有效提高復(fù)通率。中藥內(nèi)服、中藥外敷、針灸、保留灌腸等療法可以多方位、多層次、多靶點、多角度整體調(diào)治本病，均能改善患者宮腔內(nèi)環(huán)境，有利于下次受孕，提高受孕率；防止管腔再粘連，降低復(fù)發(fā)率；且創(chuàng)傷性小，經(jīng)濟安全高效，易于被患者接受。

高慧教授認為本病的病機主要在于瘀阻胞脈、胞絡(luò)，濕熱之毒蘊結(jié)于胞宮，病位在胞宮、胞絡(luò)、胞脈，絡(luò)屬于肝經(jīng)。故立法以活血化瘀、軟堅散結(jié)為主，并佐以理氣行滯、清熱利濕解毒、通管助孕之品，創(chuàng)制通管助孕方治療本病，效驗頗佳。該方由皂角刺、穿心蓮、香附、當(dāng)歸、柴胡、丹參、蒲公英、青皮、路路通、紅花、通草、白芍組成，方中重用排毒祛膿的皂角刺為君，以其鋒銳直達患處，促進管腔疏通，癰膿消散。臣以當(dāng)歸、紅花、丹參活血祛瘀，軟堅散結(jié)，通經(jīng)活絡(luò)止痛，以疏通胞脈、胞絡(luò)，促進血液暢行；臣以穿心蓮、蒲公英清熱解毒燥濕，涼血消癰散結(jié)，抑制炎性滲出及瘢痕形成，以發(fā)揮抗炎抗粘連作用，共為臣藥。佐以白芍養(yǎng)血斂陰，柔脈止痛，防止諸藥破血妄行，使血行有度；佐以柴胡、香附、青皮疏肝行氣，引諸藥入肝經(jīng)，肝脈過陰器，以達疏通輸卵管之用。使以路路通、通草通經(jīng)利水，消腫止痛，以發(fā)揮抗炎消腫止痛之功。

本實驗陽性對照藥物選用了人胎盤組織液和丹黃祛瘀膠囊。人胎盤組織液是人胎盤組織經(jīng)酸水解后的混合物，具有活血通絡(luò)止痛、軟堅散結(jié)消癥之效，常用于治療盆腔炎、術(shù)后宮腔粘連、瘢痕組織的消除等。研究表明，人胎盤組織液具有抗炎、抗粘連、抑制結(jié)締組織增生、修復(fù)內(nèi)皮功能、修復(fù)卵巢功能等作用，可以減輕輸卵管炎癥，消散積液，松解粘連，通管助孕，從而有利于輸卵管功能的恢復(fù)[8]，因此選擇此藥作為西藥對照藥物。丹黃祛瘀膠囊具有活血消腫止痛、軟堅散結(jié)消癰之功，可緩解慢性盆腔疼痛，消散盆腔炎性包塊，并且可以提高輸卵管炎性不孕患者正常妊娠率[9]，因此選擇該藥作為中成藥對照藥物。

NF-κB 是一種能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因的增強子κB 序列特異結(jié)合并促進κ 輕鏈基因表達的蛋白因子[10]，是調(diào)控免疫反應(yīng)的一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，存在于各種細胞，可通過調(diào)控其下游炎性因子而參與細胞免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的調(diào)控[11]。NF-κB通路可被炎癥因子、多脂糖、細菌等激活，活化的NF-κB 轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，NF-κB 會激活與炎癥、免疫、細胞凋亡、細胞增殖和分化有關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄[12]。活化的NF-κB 在細胞核內(nèi)調(diào)控TNF-α、COX-2、PGE2 等炎癥因子大量產(chǎn)生，引起大量炎性細胞浸潤，炎癥因子再次激活NF-κB 通路，從而產(chǎn)生炎性因子瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)[13]，進而加劇炎癥反應(yīng)，加重輸卵管損傷而致瘢痕組織形成，引起管腔粘連阻塞而致不孕。

IκB 是NF-κB 主要的內(nèi)源性抑制因子，存在于胞漿中，能夠抑制NF-κB 核移位。IκB 蛋白家族成員主要包括IκBα、IκBβ、IκBε、IκBγ、IκBδ 等構(gòu)成NF-κB 通路的典型抑制劑，其中IκBα 作為NF-κB信號通路的負調(diào)節(jié)劑發(fā)揮主要作用[14]。IκBα 既可以與細胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB 結(jié)合使其處于失活狀態(tài)，又可以與細胞核內(nèi)的NF-κB 結(jié)合，此時NF-κB 與IκBα的結(jié)合能力強于與κ 輕鏈基因的結(jié)合能力，促進NF-κB 解離失活，再次轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)內(nèi)，從而形成負反饋調(diào)節(jié)，抑制NF-κB 通路傳導(dǎo)[15]，從而下調(diào)促炎因子COX-2、PGE2 的表達。

COX-2 是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶之一，COX-2 是誘導(dǎo)型酶，在發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可以促進前列腺素的合成。NF-κB 通路的激活會引起炎癥反應(yīng)，活化的NF-κB 與COX-2 基因啟動子區(qū)域的NF-κB 位點基因序列相結(jié)合，引起COX-2 表達上調(diào)，COX-2 可以促進PGE2 的產(chǎn)生，進而引起NF-κB 下游信號通路COX2/PGE2 的激活，進一步加劇炎癥反應(yīng)[16]。

PGE2 是一種源自花生四烯酸代謝產(chǎn)生的活性脂質(zhì)化合物，是具有免疫抑制活性的促炎因子。PGE2 不僅可以促進炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)成纖維細胞的增殖，引起炎區(qū)纖維化，同時還能增強緩激肽、組織胺的致痛作用[17]。在輸卵管發(fā)生炎癥反應(yīng)時，PGE2能夠刺激組胺釋放，增強血管通透性，導(dǎo)致炎性滲出液增多，進而影響輸卵管的蠕動功能，使卵子的運行受阻，精卵不能相遇，進而造成輸卵管炎性不孕[18-19]。

研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中及輸卵管組織中的促炎因子NF-κB、COX-2、PGE2 蛋白及基因的表達明顯升高，抗炎因子IκB蛋白及基因的表達明顯降低，提示造模成功。通管助孕方能夠顯著下調(diào)大鼠血清及輸卵管組織中促炎因子NF-κB、COX-2、PGE2 蛋白及基因的表達，上調(diào)抗炎因子IκB 的表達，抑制炎癥反應(yīng)，減輕炎性滲出，抑制管腔組織纖維化、粘連形成，修復(fù)輸卵管黏膜和纖毛，疏通管腔，并促進輸卵管功能的恢復(fù)。通管助孕方治療輸卵管阻塞性不孕癥的作用機制可能是通過抑制促炎因子NF-κB、COX-2、PGE2的表達，上調(diào)抗炎因子IκB 的表達以限制NF-κB 核移位，使大量NF-κB 失活，減少COX-2、PGE2 的釋放，從而阻斷了NF-κB信號通路的傳導(dǎo)。

在輸卵管組織形態(tài)學(xué)方面，肉眼觀察下，與模型組比較，通管助孕方低劑量組大鼠管腔輕微腫脹，與周圍組織粘連較輕，淡紅有光澤，質(zhì)較硬；中、高劑量組大鼠輸卵管組織形態(tài)逐漸趨于正常。肉眼觀察下，高劑量組大鼠輸卵管走行對稱，無迂曲變形，管腔通暢，管腔粗細均勻，光滑潤澤，與周圍組織輕微粘連，質(zhì)地柔軟，富有彈性。光鏡觀察下，高劑量組大鼠管壁結(jié)構(gòu)清晰，管腔基本通暢；纖毛無粘連；較少纖維結(jié)締組織增生，無炎性細胞浸潤。表明通管助孕方具有顯著的抗炎抗粘連作用，從而有效疏通管腔，促進輸卵管結(jié)構(gòu)的修復(fù)。

綜上所述，通管助孕方可以有效抑制機體炎癥反應(yīng)，明顯減輕輸卵管組織的病理損傷程度，疏通輸卵管并恢復(fù)其功能，其治療本病的作用機制可能是通過抑制NF-κB信號通路的活化實現(xiàn)的，為通管助孕方的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。