基于Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路探究針刺療法對(duì)高脂血癥大鼠氧化應(yīng)激與脂質(zhì)水平的影響

岳盼盼，張為民，楊 東，張亞男，鄭 鵬，閆 雪*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院，長(zhǎng)春 130117）

核轉(zhuǎn)錄E2相關(guān)因子2（Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）/血紅素氧合酶（HO-1）信號(hào)通路在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)下游因子的表達(dá)，提高機(jī)體抗氧化能力保護(hù)細(xì)胞組織[1]。中醫(yī)針刺療法在治療高脂血癥方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，對(duì)脂質(zhì)代謝具有雙向調(diào)節(jié)作用[2]，而針刺療法治療高脂血癥是否通過(guò)影響氧化應(yīng)激水平而發(fā)揮療效未有明確研究證實(shí)，故本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)Nrf2信號(hào)通路，探討其作用機(jī)制，為針刺療法治療高脂血癥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，并為臨床治療高脂血癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)Wistar大鼠32只，雄性，體質(zhì)量170～200 g，購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）-2018-0007，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0014。所有動(dòng)物均進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由獲得食水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度為55%±2%，12 h光照/12 h黑暗周期。

1.1.2 儀器與試劑 阿托伐他汀鈣片（立普妥，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20051408，規(guī)格：每片20 mg）購(gòu)自輝瑞制藥有限公司；一次性針灸用具（規(guī)格：0.25 mm×40 mm；生產(chǎn)批號(hào)：200302）購(gòu)自貴州安迪藥械有限公司；高脂飼料（基礎(chǔ)飼料47%、蔗糖10%、蛋黃粉20%、豬油20 g、膽固醇2%、脫氧膽酸鈉1%），飼喂用玉米芯墊料購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)春億思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；總膽固醇（TC，批號(hào)：20210926EX）、三酰甘油（TG，批號(hào)：20210926EQ）、低密度脂蛋白（LDL，批號(hào)：20210926EE）、高密度脂蛋白（HDL，批號(hào)：20210926ET）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)：20210926EN）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)：20210926EF）、超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)：20210926EX）、過(guò)氧化氫酶（CAT，批號(hào)：20210926EC）、丙二醛（MDA，批號(hào)：20210926EC）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海晶美生物技術(shù)有限公司；Nrf2抗體（BS1074R）、HO-1抗體（Bioss，BS23667R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、Keap1抗體（Solarbio，K001511P）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。病理石蠟切片機(jī)（biocut）、石蠟切片展片機(jī)（HI1210）、生理組織包埋機(jī)（arcadia H，arcadia C）均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù) 將32只Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、藥物組和針刺組，各8只。空白組飼喂普通飼料，飲用蒸餾水；其他3組根據(jù)高脂飲食飼喂的方法構(gòu)建高脂血癥模型，采用高脂飼料（基礎(chǔ)飼料47%、蔗糖10%、蛋黃粉20%、豬油20 g、膽固醇2%、脫氧膽酸鈉1%）、15%（M/V）果糖溶液共同飼喂，自由飲食、飲水，不限活動(dòng)，4周末檢測(cè)大鼠的血脂水平，與空白組相比，模型組大鼠出現(xiàn)TC、TG、LDL水平升高，HDL水平降低，表明高脂血癥大鼠模型建立成功。造模成功后藥物組給予阿托伐他汀鈣片2.5 mg·kg-1灌胃，每日1次；針刺組固定于自制的大鼠固定器上，針刺雙側(cè)曲池（4 mm）、足三里（2 mm），采用單手進(jìn)針?lè)ǎ?.25 mm×40 mm針具，每次30 min，每日1次，每周5次，連續(xù)治療4周。治療期間空白組與模型組僅進(jìn)行固定，未行針刺。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)制備 末次治療后，所有大鼠禁食不禁水24 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，心臟取血，血液樣品37 ℃恒溫箱孵育1 h后，4 ℃恒溫放置3 h，隨后5 000 r·min-1離心10 min，采集血清。隨后脫頸處死大鼠，解剖摘取肝臟，去除臟器周?chē)Y(jié)締組織與臟器表面血，將肝臟一分為二，其中一份立即放置液氮中速凍后置于-80 ℃用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot），另一份于10%多聚甲醛中固定用于蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.2.3 生化分析 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定血清TC、TG、LDL、HDL、ALT、AST、SOD、CAT、MDA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 肝組織固定，石蠟包埋，病理切片機(jī)取8 μm厚的切片，行常規(guī)HE染色。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 使用RIPA試劑盒制備總蛋白提取物，組織勻漿用12 000 r·min-1，4 ℃，離心4 min，取上清液為總蛋白溶液，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量并調(diào)整到均勻濃度。蛋白質(zhì)樣品與10.0%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上90 min。NC膜經(jīng)用3% BSA封閉液中封膜1 h后，與特異性一抗Nrf2（1:1 000）、Keap1（1:500）、HO-1（1:1 000）在4 ℃環(huán)境下孵育12 h，用含0.05%Tween-20的Tris鹽酸緩沖液（TBST）清洗NC膜，然后用1:3 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗在37 ℃中孵育1 h。使用Image Quant LAS 4000（Fuji Film，Tokyo，Japan）對(duì)條帶進(jìn)行量化，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清TC、TG、LDL、HDL水平比較

見(jiàn)表1。

表1 各組血清中TC、TG、LDL、HDL水平的比較（±s，n = 8） mmol·L-1

表1 各組血清中TC、TG、LDL、HDL水平的比較（±s，n = 8） mmol·L-1

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與藥物組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別TCTGLDLHDL空白組1.60±0.080.65±0.080.73±0.141.01±0.11模型組2.75±0.11##1.24±0.14##1.52±0.09##0.59±0.07##藥物組2.14±0.04△△0.71±0.04△△0.98±0.09△△0.81±0.06△△針刺組2.38±0.05△△▲▲1.02±0.07△△▲▲1.22±0.07△△▲▲0.72±0.05△△▲

2.2 各組血清中ALT、AST水平比較

見(jiàn)表2。

表2 各組血清中ALT、AST水平比較（±s，n = 8） U·L-1

表2 各組血清中ALT、AST水平比較（±s，n = 8） U·L-1

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與藥物組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別ALTAST空白組37.53±2.5830.59±2.37模型組56.81±2.71##48.61±3.05##藥物組47.78±1.00△△37.27±1.98△△針刺組50.08±1.26△△▲43.79±3.15△△▲▲

2.3 各組血清中SOD、MDA、CAT的水平比較

見(jiàn)表3。

表3 各組血清中SOD、MDA、CAT的水平比較（±s，n= 8）

表3 各組血清中SOD、MDA、CAT的水平比較（±s，n= 8）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與藥物組比較，▲▲P＜0.01

組別SOD/（ U·L-1）MDA/（mmol·L-1）CAT/（ U·L-1）空白組210.56±9.76 5.98±0.39301.16±10.18模型組129.90±12.02##12.04±1.15##234.76±9.61##藥物組177.33±7.72△△ 6.45±0.68△△285.65±3.77△△針刺組152.18±11.05△△▲▲10.24±1.02△△▲▲268.34±7.30△△▲▲

2.4 各組肝臟組織病理變化

空白組肝臟細(xì)胞形態(tài)正常，肝臟組織細(xì)胞質(zhì)豐富，大小均勻，以中央靜脈為中心向周?chē)派錉钆帕小ＤＰ徒M肝細(xì)胞排列略紊亂，出現(xiàn)輕度脂肪病變。與模型組比較，針刺組及藥物組肝臟組織脂肪性病變程度較低。見(jiàn)圖1。

2.5 各組Nrf2、HO-1、Keap1蛋白表達(dá)水平比較

見(jiàn)表4。

表4 各組肝臟組織Nrf2、HO-1、Keap1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

本研究選用的足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)腧穴，是本經(jīng)合穴，也是胃之下合穴，經(jīng)相關(guān)研究[5]表明降脂效果確切且能夠影響脂質(zhì)代謝通路的信號(hào)傳導(dǎo)；曲池為手陽(yáng)明大腸經(jīng)合穴，可通腑泄?jié)幔麧袂鍩幔鸬交到禎帷⑦\(yùn)脾通腑的作用，可有效降低三酰甘油、總膽固醇及低密度脂蛋白的水平[6]；且陽(yáng)明為多氣多血之經(jīng)，配以兩經(jīng)合穴，以行氣活血，除濕化痰通絡(luò)。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)針刺大鼠可以使血清TC、TG、LDL水平下降，HDL水平上升，表明針刺療法能夠使高脂血癥大鼠脂質(zhì)水平得以下降；模型組ALT、AST水平升高，針刺組ALT、AST水平降低。進(jìn)一步病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，脂肪性病變出現(xiàn)于模型組肝臟，相對(duì)而言，針刺組肝臟脂肪性病變程度較低，說(shuō)明針刺療法能夠改善肝臟細(xì)胞變性程度，同時(shí)還可以保護(hù)高脂血癥模型的肝臟功能。

Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化-抗氧化軸的重要途徑。長(zhǎng)期高脂血癥狀態(tài)下，肝臟出現(xiàn)脂肪變性等病理性改變，并伴隨著Nrf2蛋白的表達(dá)上升[7]。在此信號(hào)通路中，Nrf2作為抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2與Keap1分離，游離的Nrf2易位到細(xì)胞核，進(jìn)一步激活HO-1等下游基因的表達(dá)[8]。本實(shí)驗(yàn)中模型組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)高于空白組，Keap1蛋白表達(dá)低于空白組，可能是由于肝臟脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路啟動(dòng)抗氧化應(yīng)激程序以減低損傷，進(jìn)而保護(hù)肝臟細(xì)胞；針刺組和藥物組Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)高于模型組，Keap1蛋白表達(dá)低于模型組，結(jié)合前期MDA含量下降，SOD、CAT水平上升，提示針刺療法可改善高脂血癥大鼠肝臟功能，其提高機(jī)體抗氧化能力與Nrf2/Keap1/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。