四味生精口服液治療腎陽(yáng)虛模型大鼠實(shí)驗(yàn)研究

郭丁禹，肖井雷

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，腎虛患者人數(shù)日趨增多，治療藥物市場(chǎng)需求規(guī)模較大。現(xiàn)治療藥物主要分中、西藥兩大類(lèi)，西藥主要為激素類(lèi)，起效快但治標(biāo)不治本；中藥與西藥相比雖然起效慢，但在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，能全面調(diào)理人體陰陽(yáng)平衡達(dá)到治愈病癥的目的，且副作用小，因此治療此類(lèi)病癥的中成藥一直深受病患的認(rèn)可。本研究通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，從激素水平、臟器系數(shù)以及組織形態(tài)學(xué)等方面驗(yàn)證了藥物的治療作用，為推動(dòng)中醫(yī)癥候研究向現(xiàn)代化邁進(jìn)貢獻(xiàn)了綿薄之力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物信息表

1.2 藥品

四味生精口服液（生產(chǎn)企業(yè)：浙江康恩貝制藥股份有限公司）；金匱腎氣丸（生產(chǎn)企業(yè)：北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)：20030131）。

1.3 儀器試劑

見(jiàn)表2。

表2 儀器試劑表

1.4 給藥

見(jiàn)表3。

表3 給藥信息表

1.5 劑量設(shè)計(jì)

1）金匱腎氣丸：每日攝入量為50粒，按70 kg人和200 g大鼠等效劑量折算指數(shù)法可得，大鼠等效劑量為50×0.018×5 = 4.5粒·kg-1·d-1；2）四味生精口服液：日服劑量為10 mL，按70 kg人和200 g大鼠等效劑量折算指數(shù)法可得，大鼠等效劑量為10×0.018×5 = 0.9 mL·kg-1·d-1。各組給藥劑量見(jiàn)表4。

表4 劑量設(shè)計(jì)表

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 模型建立[1]選擇糖皮質(zhì)激素肌肉注射建立大鼠腎陽(yáng)虛模型，除空白對(duì)照組后肢交替肌肉注射生理鹽水外，其余各組均后肢交替肌注氫化可的松25 mg·kg-1·d-1，連續(xù)造模14 d。

1.6.2 給藥分組 造模14 d后分組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（金匱腎氣丸）、四味生精口服液高、中、低劑量組，共6組。第3周起，按10 mL·kg-1灌胃給藥，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.6.3 指標(biāo)檢測(cè)[2-5]末次給藥后，將大鼠按體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛10 mL·kg-1麻醉。1）腹主動(dòng)脈取血，3 000 rpm·min-1離心10 min分離血清，采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清睪酮（T）與雌二醇（E2）水平；2）取睪丸、前列腺、附睪稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)；3）取附睪置于5 mL生理鹽水中，剪碎，用4層擦鏡紙過(guò)濾，取濾液1 mL，加9 mL生理鹽水，制備精子懸液，將精子懸液在37℃水浴中孵育20 min，備用。取1滴精子懸液滴到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，于顯微鏡下計(jì)數(shù)各方格的精子數(shù)，將精子數(shù)換算為1 mL懸液中所含精子總數(shù)。取1滴精子懸液，加入1滴精子活體染色試劑盒染液于載玻片一端，混勻；制成抹片，鏡下檢查，活的精子頭部為無(wú)色透明，死亡精子變?yōu)榉奂t色。觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)活精子數(shù)，計(jì)算精子存活率。

1.6.4 病理檢測(cè) 末次給藥后，將大鼠按體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛10 mL·kg-1麻醉。取睪丸，采用10%甲醛固定，常規(guī)脫水處理、石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡觀察。采用NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)400倍鏡下測(cè)量生精小管上皮細(xì)胞層高度（μm）和生精小管橫截面中生精細(xì)胞所占的面積（μm2），統(tǒng)計(jì)比較各給藥組中藥物對(duì)睪丸生精細(xì)胞分化狀態(tài)的改善作用。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件與試劑盒配套數(shù)據(jù)分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組血清睪酮（T）與雌二醇（E2）水平比較

見(jiàn)表5。

表5 各組血清睪酮（T）與雌二醇（E2）水平比較（±s，n= 10）

注：與空白對(duì)照組比較，### P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，△△△P＜0.001

組別劑量/（mL·kg-1）T/（nmol·L-1）E2/（ng·L-1）空白對(duì)照組—37.56±8.95 35.93±9.79模型對(duì)照組—17.95±8.44###112.42±40.06###陽(yáng)性對(duì)照組4.5粒/kg32.86±4.34△△△ 33.89±10.24△△△四味生精口服液高劑量組3.636.92±6.56△△△ 35.65±8.31△△△四味生精口服液中劑量組1.831.18±8.05△△△ 36.74±8.66△△△四味生精口服液低劑量組0.932.16±6.73△△△ 30.18±7.30△△△

2.2 各組睪丸、附睪、前列腺臟器指數(shù)比較

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組睪丸、附睪、前列腺臟器系數(shù)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與模型對(duì)照組比較，各給藥組睪丸、附睪、前列腺臟器系數(shù)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

2.3 各組精子總數(shù)與精子存活率比較

見(jiàn)表6。

表6 各組精子總數(shù)與精子存活率比較（±s，n= 10）

表6 各組精子總數(shù)與精子存活率比較（±s，n= 10）

注：與空白對(duì)照組比較，## P＜0.01，### P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

組別劑量/（mL·kg-1）精子總數(shù)（106）精子存活率/%空白對(duì)照組—5.47±1.2591.62±3.78模型對(duì)照組—3.48±0.85##27.17±2.91###陽(yáng)性對(duì)照組4.5粒/kg5.44±0.77△△78.83±6.34△△△四味生精口服液高劑量組3.65.55±0.60△△△83.93±5.65△△△四味生精口服液中劑量組1.85.46±0.46△△△87.39±5.86△△△四味生精口服液低劑量組0.95.25±0.44△△88.03±3.04△△△

2.4 各組病理檢測(cè)結(jié)果

1）空白對(duì)照組：睪丸生精小管中各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)整，生精小管結(jié)構(gòu)正常。大鼠生精小管飽滿，結(jié)構(gòu)完整，小管內(nèi)生精上皮層數(shù)清晰完整，各級(jí)生精細(xì)胞排列整齊有序，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量成形的精子細(xì)胞。2）模型對(duì)照組：睪丸生精小管中生精細(xì)胞排列紊亂、上皮變薄，大部分管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的精子細(xì)胞，少數(shù)可見(jiàn)精母細(xì)胞脫落；且可見(jiàn)到生精細(xì)胞分化成熟過(guò)程受阻。3）各給藥組：睪丸組織結(jié)構(gòu)趨向正常，生精小管中各級(jí)生精細(xì)胞排列基本規(guī)整，生精小管結(jié)構(gòu)基本正常；生精小管萎縮和生精小管上皮變薄的現(xiàn)象有顯著的改善作用；具有改善和促進(jìn)睪丸生精的作用，改善生精細(xì)胞向精子形成的分化過(guò)程，促進(jìn)精子細(xì)胞的成熟過(guò)程。見(jiàn)圖1。

圖1 睪丸組織病理切片結(jié)果

2.5 各組睪丸形態(tài)測(cè)量結(jié)果比較

見(jiàn)表7。

表7 各組睪丸形態(tài)測(cè)量結(jié)果比較（±s，n= 10）

表7 各組睪丸形態(tài)測(cè)量結(jié)果比較（±s，n= 10）

注：與空白對(duì)照組比較，## P＜0.01，### P＜0.001；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

組別劑量/（mL·kg-1）生精小管上皮細(xì)胞層高度/μm生精小管橫截面中生精細(xì)胞所占面積/μm2空白對(duì)照組—75.128±12.31143 916.112±10 859.114模型對(duì)照組—54.746±8.935##20 671.362±3 117.232###陽(yáng)性對(duì)照組4.5粒/kg64.634±8.666△34 813.560±9 837.763△△四味生精口服液高劑量組3.668.542±11.377△△42 346.034±8 096.353△△△四味生精口服液中劑量組1.865.791±12.175△33 253.611±10 083.127△△四味生精口服液低劑量組0.966.306±11.711△33 037.434±9 112.934△△

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腎為命門(mén)所附，為先天之本，與人的生長(zhǎng)發(fā)育生殖排泄有著極其密切的關(guān)系，因其只宜固藏，不宜泄露，所以腎病多虛證。腎虛包括陰、陽(yáng)、氣、精的虧損。腎虛以腎陰虛和腎陽(yáng)虛為主。陰虛包括腎陰虧虛和陰虛火旺，陽(yáng)虛包括腎氣不固，腎不納氣，腎陽(yáng)不振，腎虛水泛[6]。糖皮質(zhì)激素注射是腎虛模型較常用的造模方法，本實(shí)驗(yàn)中采用氫化可的松肌肉注射復(fù)制大鼠腎陽(yáng)虛模型，造模后動(dòng)物出現(xiàn)狀態(tài)萎靡、弓腰、毛發(fā)蓬松等現(xiàn)象，且病理檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠睪丸中生精細(xì)胞層厚度與生精細(xì)胞所占面積明顯減少（P＜0.01，P＜0.001），說(shuō)明模型復(fù)制成功。

睪酮（T）又稱(chēng)睪丸素、睪丸酮、睪甾酮，是男性最重要的雄激素，男性睪酮全部在睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)合成。具有促進(jìn)和維持生殖器官以及第二性征的發(fā)育和生長(zhǎng)，維持前列腺和儲(chǔ)精囊等器官功能的作用。同時(shí)，睪酮可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)及紅細(xì)胞生成的作用。雌二醇（E2）是一種甾體雌激素，溫特斯坦納等[7]曾從妊娠馬尿中提取出來(lái)，此外也可從妊婦尿、人胎盤(pán)、豬卵巢等中獲得，因?yàn)樗泻軓?qiáng)的性激素作用，所以認(rèn)為它或它的酯實(shí)際上是卵巢分泌的最重要的性激素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與模型對(duì)照組比較，各給藥組T含量均明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；E2含量均明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；各組均精子總數(shù)均明顯升高（P＜0.01，P＜0.001）；各組精子存活率均有明顯升高（P＜0.001）；各給藥組均可以明顯增加模型大鼠睪丸生精小管上皮厚度與生精細(xì)胞橫截面積（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

綜上所述，四味生精口服液可改善腎陽(yáng)虛模型大鼠血清性激素水平，并可有效提高大鼠精子存活率，可改善模型大鼠睪丸組織中生精小管上皮細(xì)胞的生精狀態(tài)，保護(hù)睪丸生精細(xì)胞，促進(jìn)生精細(xì)胞分化進(jìn)程，促進(jìn)精子生成，表明其對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠具有較好的治療作用。