‘茶花’藍莓莖段初代培養(yǎng)體系建立

朱秀蕾，張 林，余碧霞

（安慶職業(yè)技術學院農(nóng)林與服裝學院，安慶 246003）

藍莓（Vacciniumspp.）屬杜鵑花科越桔屬多年生灌木，又稱藍漿果或越桔，落葉或常綠果樹，果實為小漿果類，果皮較薄，果肉酸甜，原產(chǎn)地和主要產(chǎn)區(qū)均在北美洲地區(qū)[1]。由于藍莓果實具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能，可以改善人類亞健康狀況，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[2]。‘茶花’藍莓又稱為卡米爾藍莓，美國佐治亞大學2005年推出的中早熟南高叢藍莓品種，植株高且枝條生長旺盛，直立，樹冠開張但冠幅較窄，果粒大，果實亮藍色，果蒂痕小而干，果實硬度好且風味佳，適合鮮食市場。傳統(tǒng)的扦插繁殖和種子繁殖耗時長、效率低，采用植物組織培養(yǎng)技術可快繁藍莓種苗[3]。目前‘茶花’藍莓品種初代培養(yǎng)的研究鮮有報道，所以本研究以‘茶花’藍莓為試材，探討滅菌劑、誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基等因素對‘茶花’藍莓初代培養(yǎng)的影響，從而為‘茶花’藍莓組培快繁體系的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：‘茶花’藍莓當年新抽出的半木質化莖段，采自安慶職業(yè)技術學院園林園藝基地。

供試試劑：玉米素（zeatin，ZT），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA），上海宇航生物科技有限公司；吲哚-3乙酸（3-indoleacetic acid，IAA），廣州市林國化肥有限公司。

供試培養(yǎng)基：改良WPM培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖[4]。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選擇與處理 將采集的‘茶花’藍莓帶腋芽莖段放入有少量洗衣粉的清水中清洗，然后用解剖刀切割成2～3 cm段，先在流水下不斷沖洗30 min，再用無菌水沖洗，瀝干水后，將試材放到超凈工作臺[5]。

1.2.2 外植體滅菌劑處理 將75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液2種滅菌劑設為2個因素，按不同的滅菌時間設置3個水平，A1、A2、A3分別為75%乙醇漂洗10、20、30 s；N1、N2、N3分別為2.5%次氯酸鈉溶液消毒5、10、15 min；交叉組合共9個處理（A1N1、A1N2、A1N3、A2N1、A2N2、A2N3、A3N1、A3N2、A3N3），重復3次。

1.2.3 外植體接種 將莖段與滅菌劑接觸的兩頭剪掉，莖段截成0.5～0.7 cm作為外植體接種于培養(yǎng)基中，改良WPM+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g /L，pH 5.8，重復3次，每處理接種5瓶，每個培養(yǎng)瓶接種10個外植體，置于溫度為（28±2）℃、光照強度為1 500～2 000 lx、光照時間為12 h/d下培養(yǎng)，10 d后統(tǒng)計‘茶花’藍莓莖段外植體成活率。外植體成活率（%）=外植體成活總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.2.4 誘導培養(yǎng)基篩選 將滅菌的‘茶花’藍莓莖段外植體分別接種到改良WPM，附加不同質量濃度配比的6-BA、ZT誘導培養(yǎng)基中。6-BA質量濃度設置4個水平，B1、B2、B3、B4的6-BA質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L；ZT質量濃度設置3個水平，Z1、Z2、Z3的ZT質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；交叉組合共12個處理（B1Z1、B1Z2、B1Z3、B2Z1、B2Z2、B2Z3、B3Z1、B3Z2、B3Z3、B4Z1、B4Z2、B4Z3），重復3次，每處理接種5瓶，每個培養(yǎng)瓶接種10個外植體，置于溫度為（28±2）℃、光照強度為 1 500～2 000 lx、光照時間為12 h/d下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計‘茶花’藍莓叢生芽誘導率。叢生芽誘導率（%）=不定芽誘導總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.2.5 增殖培養(yǎng)基篩選 經(jīng)誘導培養(yǎng)基生成的叢生芽分別接種到改良WPM，附加不同質量濃度配比的IAA、ZT增殖培養(yǎng)基中。IAA質量濃度設置3個水平，I1、I2、I3的IAA質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L；ZT質量濃度設置3個水平，Z1、Z2、Z3的ZT質量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/L；交叉組合共9個處理（I1Z1、I1Z2、I1Z3、I2Z1、I2Z2、I2Z3、I3Z1、I3Z2、I3Z3），重復3次，每處理接種5瓶，每個培養(yǎng)瓶接種10個叢生芽，置于溫度為（28±2）℃、光照強度為1 500～2 000 lx、光照時間為12 h/d下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計‘茶花’藍莓叢生芽增殖率。叢生芽增殖率（%）=叢生芽分化總數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 2006軟件統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Turkey檢驗法進行組間顯著性差異檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌劑對‘茶花’藍莓莖段外植體成活率的影響

由表1可知，‘茶花’藍莓莖段外植體在A3N2處理中成活率與其他處理比較差異顯著，在A2N2和A3N3處理、A1N3和A2N1處理中成活率差異不顯著。如果滅菌時間較短，‘茶花’藍莓莖段外植體接種后第3天出現(xiàn)污染，A1N1處理污染嚴重。隨著消毒時間延長，污染率逐漸下降。如果75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液滅菌時間過度，外植體成活率降低。綜上，A3N2處理滅菌效果最好，外植體成活率最高，為96.21%，所以‘茶花’藍莓莖段外植體表面滅菌除了選擇合適的滅菌劑種類外，選擇合適的滅菌時間也很重要。

表1 不同滅菌劑對‘茶花’藍莓莖段外植體成活率的影響

2.2 不同6-BA、ZT處理對‘茶花’藍莓莖段外植體叢生芽誘導率的影響

由表2可知，‘茶花’藍莓莖段在B3Z2處理中叢生芽誘導率與其他處理比較差異顯著，在B2Z3、B3Z1、B3Z3、B4Z2處理中對叢生芽誘導率的影響差異不顯著。‘茶花’藍莓莖段叢生芽誘導主要受培養(yǎng)基中細胞分裂素調控，6-BA對‘茶花’藍莓莖段叢生芽誘導率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。當ZT質量濃度為0.5～1.5 mg/L時，‘茶花’藍莓莖段叢生芽誘導率呈先升高后降低的趨勢，當ZT質量濃度為1.0 mg/L時，‘茶花’藍莓莖段叢生芽誘導率最高。綜上，在B3Z2處理中誘導效果最好，‘茶花’藍莓莖段外植體叢生芽誘導率最高，為97.91%。

表2 6-BA、ZT配比對‘茶花’藍莓莖段外植體叢生芽誘導率的影響

2.3 不同IAA、ZT處理對‘茶花’藍莓叢生芽增殖率的影響

由表3可知，‘茶花’藍莓在I2Z2處理中叢生芽增殖率與其他處理比較差異顯著，在I1Z2和I2Z1處理中對叢生芽增殖率差異不顯著。‘茶花’藍莓莖段叢生芽增殖主要受培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素調控，IAA對‘茶花’藍莓莖段叢生芽增殖率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。當ZT質量濃度為1.0～2.0 mg/L時，‘茶花’藍莓莖段叢生芽增殖率呈先升高后降低的趨勢，當ZT質量濃度為1.5 mg/L時，‘茶花’藍莓叢生芽增殖率最高。綜上，在I2Z2處理中增殖效果最好，‘茶花’藍莓叢生芽增殖率最高，為93.01%

表3 IAA、ZT配比對‘茶花’藍莓叢生芽增殖率的影響

3 討 論

3.1 不同滅菌劑處理對‘茶花’藍莓莖段外植體成活率的影響

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)無菌培養(yǎng)體系構建的第一步。外植體從室外采集時上面附著大量的細菌和病毒，滅菌劑的種類、濃度、滅菌時間直接影響外植體的滅菌效果，金如意等[6]研究表明，5%NaClO溶液消毒10 min，再用0.1% HgCl2溶液消毒7 min外植體的消毒效果最好。但是因HgCl2溶液有劇毒，在實際生產(chǎn)中存在著巨大的安全隱患，所以筆者通過試驗尋求既安全又高效的滅菌方法，在‘茶花’藍莓的組織培養(yǎng)過程中，研究不同滅菌劑對‘茶花’藍莓莖段外植體成活率的影響。本研究表明，如果滅菌時間較短，‘茶花’藍莓莖段外植體接種后第3天出現(xiàn)污染。隨著消毒時間延長，污染率逐漸下降，而75%乙醇和2.5%次氯酸鈉溶液滅菌時間過度，外植體的成活率降低。

3.2 不同植物生長調節(jié)劑組合對‘茶花’藍莓初代培養(yǎng)的影響

植物生長激素中的細胞分裂素對藍莓叢生芽的誘導和增殖起到了至關重要的作用，且藍莓品種不同所適用的細胞分裂素種類和用量也不同。廉家盛等[7]研究表明，ZT對藍莓叢生芽的誘導和增殖具有顯著效果，且不同的藍莓品種用量也有差別。本研究表明，在‘茶花’藍莓初代培養(yǎng)過程中，當ZT質量濃度為0.5～1.5 mg/L時，‘茶花’藍莓莖段外植體叢生芽誘導率呈先升高后降低的趨勢，當ZT質量濃度為1.0 mg/L時，‘茶花’藍莓莖段外植體叢生芽誘導率最高。當ZT質量濃度為1.0～2.0 mg/L時，‘茶花’藍莓叢生芽增殖率呈先升高后降低的趨勢，當ZT質量濃度為1.5 mg/L時，‘茶花’藍莓叢生芽增殖率最高。而6-BA對‘茶花’藍莓叢生芽誘導率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT，與李森等[8]研究結論一致。IAA對‘茶花’藍莓叢生芽增殖率存在一定的影響，但效果顯著低于ZT。本研究對‘茶花’藍莓初代培養(yǎng)進行了探討，為‘茶花’藍莓品種的工廠化育苗和商品基地的建設奠定了基礎，對‘茶花’藍莓的生根培養(yǎng)、馴化移栽還需進一步研究。

4 結 論

本研究表明‘茶花’藍莓莖段外植體在初代培養(yǎng)過程中，‘茶花’藍莓莖段外植體用75%乙醇浸泡30 s，再用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，滅菌效果最好，成活率最高。改良WPM+6-BA 1.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L誘導培養(yǎng)基最適宜莖段腋芽誘導；改良WPM+IAA 1.0 mg/L+ZT 1.5mg /L增殖培養(yǎng)基最適宜再生芽增殖。在植物組培初代培養(yǎng)過程中，影響制約外植體成苗的因素很多，本研究僅對‘茶花’藍莓滅菌劑種類、激素質量濃度和種類進行了初探，其他不同激素配比、光照條件等因素仍需要進一步研究。