扁蒴藤素調節ROS/ASK1/JNK信號通路對二乙基亞硝胺誘導大鼠肝癌的抑制作用

劉燕 張冬華 黃渝茜 劉有順 黃驥

1贛南衛生健康職業學院醫學基礎部解剖與組胚教研室（江西贛州 341000）；2贛州市人民醫院（江西贛州 341000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最致命的癌癥之一，與肝硬化和纖維化密切相關，發展中國家的HCC病死率和發病率更高，肝癌在初始階段通常無癥狀，通常在晚期才能診斷出來，這使得手術成功變得更加困難［1］。HCC的治療策略包括化療、放療、手術和免疫治療。然而，這些治療中的大多數都伴隨著嚴重的副作用和復發。現在急需開發一種新型抗癌藥物，能夠提高治療效果［2］。二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）是一種強致癌的二烷基亞硝胺，存在于煙草煙霧、切達干酪、肉類和威士忌中。DEN代謝過程中產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可能在癌癥發展中起重要作用［3］。扁蒴藤素（pristimeri，Pris）是一種從衛矛科和海馬科植物中分離出來的天然生物活性成分，EL-AGAMY等［4］發現，Pris可以作為抗自身免疫性肝炎的新型保肝劑。Pris還具有抗腫瘤作用，Pris可以通過誘導細胞凋亡緩解HCC［5］。ROS/ASK1/JNK信號軸是癌癥研究的常見通路，研究發現［6］，激活ROS/ASK1/JNK途徑可以誘導非小細胞肺癌凋亡。ZHAO等［7］發現Pris激活ROS/ASK1/JNK途徑誘導細胞凋亡和自噬抑制乳腺癌的發生。近期，LI等［8］發現激活ROS/ASK1/JNK信號軸可以激活氧化應激緩解HCC。本研究旨在探究Pris是否可以通過激活ROS/ASK1/JNK信號軸促進細胞凋亡和氧化應激進而抑制HCC。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠（200 ～ 220 g）（許可證號：SCXK（浙）2022-0005）購自杭州啟真實驗動物科技有限公司，12 h的光/暗交替進行，自由采食和飲水，溫度設置為23 ～ 27 ℃，相對濕度為40% ～ 65%。實驗方案獲得本院動物倫理委員會批準（編號：2023J0017）。

1.2 主要試劑Pris、谷胱甘肽還原酶（GR）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；ROS/ASK1/JNK信號通路抑制劑Vaccarin購自MedChemExpress LLC；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6（IL-6）試劑盒、單核細胞趨化蛋白-1（CCL2）試劑盒武漢華美生物工程有限公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（AST）試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK抗體均購自Abcam。ROS試劑盒購自上海彩佑實業有限公司。

1.3 模型制備及分組隨機選擇6只大鼠作為對照組，其余大鼠參照先前文獻［9］造模，首先按照200 mg/kg的劑量通過腹腔注射DEN，每周1次，連續注射16周誘導HCC大鼠模型，隨機選擇3只大鼠進行HE染色。根據肝臟病理變化判斷是否造模成功。將造模成功大鼠隨機平分為HCC組、Pris組、Vaccarin組、Pris + Vaccarin組，每組均6只大鼠。Pris組參考先前文獻［4］通過腹腔注射0.8 mg/kg的Pris，連續注射1周；Vaccarin組參考先前文獻［10］通過腹腔注射100 mg/kg ROS/ASK1/JNK信號通路抑制劑Vaccarin，連續注射一周；Pris + Vaccarin組在注射0.8 mg/kg的Pris的基礎上注射100 mg/kg-Vaccarin，連續注射1周。HCC組和對照組注射等量生理鹽水。

1.4 測量體質量、肝質量以及樣本采集藥物治療結束24 h用電子稱測量大鼠體質量，隨后將大鼠麻醉，用采血針通過腹主動脈采取5 mL血液通過離心機4 000轉，離心8 min后獲取上清液，保存在-20 ℃用于ELISA試劑盒檢測。將大鼠處死解剖后取肝組織樣本稱量質量后，一部分固定在4%多聚甲醛用于病理變化觀察，一部分保存在-80 ℃用于Western blot檢測和ELISA檢測。肝臟體質量比=（肝臟質量/體質量）× 100%。

1.5 ELISA法檢測肝功能、炎性因子、抗氧化指標采用ELISA試劑盒檢測血清IL-6、TNF-α、CCL-2、SOD、GR、GPx、CAT、ROS含量，以及肝臟組織ALT、AST、ALP、LDH水平。

1.6 HE染色檢測肝臟病理變化取上述4%多聚甲醛固定的肝臟組織用乙醇脫水后包埋在石蠟中，切成4 ～ 5 μm的石蠟切片，用蘇木精和伊紅（H&E）染色。最后用中性樹膠封片，用顯微鏡觀察肝臟病理變化。

1.7 Western blot檢測細胞凋亡標志物（Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3）以及ROS/ASK1/JNK信號通路蛋白表達使用RIPA裂解緩沖液提取肝臟組織的總蛋白，蛋白質濃度通過BCA蛋白質測定試劑盒定量，將等量蛋白質通過SDS-PAGE電泳分離后轉到PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉膜，在4 ℃與下列一抗孵育一夜：Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、ASK1（1∶2 000）、JNK（1∶2 000）、p-ASK1（1∶2 000）、p-JNK（1∶2 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），TBST洗滌后，加入二抗，加ECL顯色，凝膠成像系統觀察目的條帶，目的條帶使用Image J軟件進行半定量。

1.8 統計學方法數據均用SPSS 25軟件處理，數據在進行正態分布和方差齊性檢驗后以平均值±標準差表示，單因素方差分析比較多組間差異，SNK-q檢驗比較兩組間差異。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pris對大鼠體質量、肝臟質量以及肝臟體質量比的影響與對照組相比，HCC組體質量顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05），肝臟質量、肝臟體質量比顯著增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組體質量顯著升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05），肝臟質量、肝臟體質量比顯著降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組趨勢相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組體質量顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05），肝臟質量、肝臟體質量比顯著上升，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 各組大鼠體質量、肝臟質量以及肝臟體質量比的比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

表1 各組大鼠體質量、肝臟質量以及肝臟體質量比的比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

肝臟體質量比（%）3.04 ± 0.24 8.31 ± 0.63a 3.42 ± 0.27b 17.32 ± 1.25b 7.20 ± 0.61c 296.136＜ 0.001組別對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值體質量（g）410.28 ± 55.34 281.14 ± 33.54a 389.21 ± 46.83b 200.45 ± 24.37b 298.16 ± 35.36c 26.566＜ 0.001肝臟質量（g）12.49 ± 1.28 23.35 ± 2.14a 13.34 ± 1.26b 34.73 ± 3.05b 21.46 ± 2.14c 112.499＜ 0.001

2.2 Pris對大鼠肝功能的影響與對照組相比，HCC組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組與Pris組趨勢相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組ALT、AST、ALP、LDH含量顯著上升，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表2。

表2 Pris對大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影響Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

表2 Pris對大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影響Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

組別對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值LDH（U/mL）311.57 ± 36.18 591.08 ± 63.12a 421.44 ± 45.16b 930.61 ± 95.07b 501.17 ± 53.12c 86.871＜ 0.001 ALT（U/mL）105.35 ± 11.82 279.58 ± 30.97a 134.57 ± 21.57b 416.46 ± 54.64b 210.21 ± 21.13c 93.460＜ 0.001 AST（U/mL）136.23 ± 18.64 354.14 ± 40.42a 186.07 ± 20.63b 532.48 ± 57.26b 304.57 ± 38.43c 101.324＜ 0.001 ALP（U/mL）140.89 ± 17.09 313.43 ± 38.46a 191.34 ± 20.11b 436.56 ± 49.69b 283.01 ± 30.32c 70.912＜ 0.001

2.3 Pris對大鼠炎性因子、抗氧化指標的影響與對照組相比，HCC組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組結果相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量顯著上升，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見表3、4。

表3 Pris對大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影響Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

表3 Pris對大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影響Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

TNF-α（pg/mL）0.76 ± 0.10 3.47 ± 0.44a 1.27 ± 0.16b 6.57 ± 0.68b 3.00 ± 0.35c 193.237＜ 0.001組別對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值CCL-2（pg/mL）103.64 ± 14.15 251.35 ± 25.37a 123.98 ± 13.26b 368.48 ± 47.58b 205.24 ± 24.24c 88.266＜ 0.001 IL-6（pg/mL）22.32 ± 2.73 54.34 ± 5.54a 33.59 ± 3.37b 69.57 ± 6.37b 49.34 ± 4.29c 93.392＜ 0.001

表4 Pris對大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影響Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

表4 Pris對大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影響Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

組別對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值CAT（U/mL）31.14 ± 2.42 46.23 ± 6.64a 33.07 ± 4.63b 61.48 ± 7.26b 43.57 ± 4.43c 84.278＜ 0.001 SOD（U/mL）14.35 ± 2.37 23.64 ± 3.15a 16.48 ± 1.58b 33.98 ± 5.26b 19.24 ± 2.04c 15.618＜ 0.001 GR（U/mL）16.35 ± 1.63 28.78 ± 2.91a 18.21 ± 1.78b 37.45 ± 4.75b 24.67 ± 2.56c 72.724＜ 0.001 GPx（U/mL）9.58 ± 0.97 15.35 ± 1.82a 10.46 ± 1.24b 34.57 ± 4.57b 13.21 ± 1.56c 84.278＜ 0.001

2.4 Pris對大鼠肝臟病理變化的影響對照組大鼠表現出正常的肝臟組織結構；HCC組可以觀察到部分肝細胞壞死，出現局灶性結節性增生現象；Pris組改善了肝細胞壞死以及局灶性結節性增生現象，而Vaccarin組出現大片肝細胞壞死，細胞體積增大；Pris+Vaccarin組與HCC組結構相似，見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理變化（× 200）Fig.1 Pathological changes in liver of rats in each group（× 200）

2.5 Pris對大鼠凋亡標志蛋白的影響與對照組相比，HCC組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下調（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著上調，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與HCC組相比，Pris組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著上調，差異有統計學意義（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著下調，差異有統計學意義（P＜ 0.05），而Vaccarin組與Pris組蛋白水平相反；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平顯著上升，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖2，表5。

圖2 Western blot法檢測凋亡標志蛋白水平Fig.2 Western blot method for detecting the level of apoptosis marker protein

表5 Pris對大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

表5 Pris對大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

cleaved-Caspase-3/GAPDH 1.37 ± 0.16 0.96 ± 0.10a 1.31 ± 0.14b 0.48 ± 0.05b 1.00 ± 0.12c 80.433＜ 0.001組別Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值1.26 ± 0.13 0.68 ± 0.05a 1.13 ± 0.09b 0.39 ± 0.02b 0.71 ± 0.06c 120.314＜ 0.001 0.74 ± 0.08 1.33 ± 0.15a 0.89 ± 0.17b 1.82 ± 0.09b 1.30 ± 0.15c 55.055＜ 0.001

2.6 Pris對大鼠ROS及ROS/ASK1/JNK信號通路蛋白水平的影響與對照組相比，HCC組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與HCC組相比，Pris組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05），而Vaccarin組ROS、ASK1、JNK水平顯著下降；與Pris組相比，Pris+Vaccarin組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3、4，表6。

圖3 Western blot法檢測ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平Fig.3 Western blot method for detecting ROS/ASK1/JNK pathway protein levels

表6 Pris對大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影響Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

表6 Pris對大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影響Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與HCC組比較，bP ＜ 0.05；與Pris組比較，cP ＜ 0.05

p-JNK/JNK 0.78 ± 0.09 0.44 ± 0.05a 0.72 ± 0.09b 0.27 ± 0.04b 0.50 ± 0.06c 54.753＜ 0.001組別對照組HCC組Pris組Vaccarin組Pris+Vaccarin組F值P值ROS（mg/mL）25.00 ± 2.89 10.66 ± 1.05a 21.91 ± 2.07b 5.34 ± 0.52b 13.70 ± 1.46c 116.200＜ 0.001 p-ASK1/ASK1 0.95 ± 0.05 0.52 ± 0.04a 0.83 ± 0.07b 0.38 ± 0.03b 0.66 ± 0.05c 158.283＜ 0.001

3 討論

HCC是肝細胞的原發性惡性腫瘤，根據美國國家癌癥研究所的SEER數據庫，美國HCC患者的平均5年生存率為19.6%，但晚期轉移性患者生存率可低至2.5%。當在早期階段確診時，可以進行局部治療，包括手術切除、射頻消融、經動脈化療栓塞或肝移植。然而，HCC通常在腫瘤不可切除的晚期被診斷出來，使得這些治療無效［11-12］。DEN是一種成熟的肝癌物質，它會引發肝損傷，并經常用于在動物模型中引發肝癌發生［13］。據報道［14］，DEN誘導肝癌發生的病理過程與人類肝癌更相似。因此，DEN誘導的肝癌動物模型被廣泛用于肝癌研究。本研究通過注射DEN構建HCC大鼠模型，HE染色結果顯示，對照組大鼠表現出正常的肝臟組織結構；HCC組可以觀察到部分肝細胞壞死，出現局灶性結節性增生現象，提示HCC大鼠造模成功。Pris可以通過影響細胞凋亡、自噬、遷移、侵襲、血管生成等腫瘤相關過程起到抗癌作用［15］。近期研究［5］發現，Pris可以通過抑制細胞活力、遷移和血管生成，促進細胞凋亡來抑制HCC發展。在本研究中，HCC組較對照組大鼠體質量顯著下降，肝臟質量、肝臟體質量比顯著升高，而Pris處理改善了肝細胞壞死以及局灶性結節性增生現象，Pris組較HCC組體質量顯著升高，肝臟質量、肝臟體質量比顯著下降，表明Pris可以對HCC大鼠產生積極影響。

細胞凋亡和氧化應激在HCC發展過程中起重要作用。Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase-3是參與細胞凋亡調節的關鍵蛋白［16-18］。而氧化應激抑制HCC的發生［19］。AST、ALT、ALP、LDH可用作診斷化學物質和藥物引發的肝功能改變的生物標志物［20］。研究報道稱，DEN誘導的HCC大鼠血清AST、ALT、ALP、LDH水平顯著升高［21］。KUMAR等［22］發現，HCC大鼠體內IL-6、TNF-α水平顯著升高，加重了炎癥反應。本研究結果與先前研究一致顯示，HCC組較對照組Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降，ALT、AST、ALP、LDH含量、IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx、CAT含量、Bcl-2蛋白水平顯著增加，表明DEN處理后大鼠炎癥反應升高、肝損傷加重，細胞凋亡較低。而Pris治療后促進了氧化應激及細胞凋亡，減輕了肝損傷，從而抑制HCC。

通過調控ROS/ASK1/JNK信號軸促進細胞凋亡，進而抑制癌癥的發展已多有報道。例如，MHONE等［23］發現激活ROS/ASK1/JNK信號軸可以誘導細胞凋亡，進而抑制肺腺癌的發生。且已有研究［8］發現，Pris可以通過激活ROS/ASK1/JNK信號軸誘導細胞凋亡制乳腺癌的發展。本研究發現，HCC組較對照組ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著下降，而Pris治療后ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平顯著升高，提示Pris可能通過激活ROS/ASK1/JNK信號軸抑制HCC的發生，為了進一步證實該結論，我們用ROS/ASK1/JNK信號軸抑制劑Vaccarin處理HCC大鼠，結果發現，Vaccarin逆轉了Pris對HCC大鼠的抗癌效果。

綜上所述，Pris可能通過上調ROS/ASK1/JNK信號通路促進氧化應激及細胞凋亡，進而改善HCC大鼠肝損傷。本文的新穎之處是首次研究了ROS/ASK1/JNK信號軸在HCC上的影響，進一步研究了Pris在HCC上的作用機制，本研究為治療HCC提供實驗參考數據以及潛在治療藥物。本文不足時，缺少對Pris治療的最適劑量的探究以及Pris是否可以調控其它通路起到相同效果，這將是后續研究的方向。