試析PCR 技術在食品微生物檢測中的運用策略

◎ 鄒曉花，方瑞雪

（西部第三方檢測集團（寧夏）有限公司，寧夏 銀川 750021）

本文旨在試析PCR（聚合酶鏈反應）技術在食品微生物檢測中的運用策略。通過系統研究PCR 技術的原理、步驟和應用案例，探討了如何選擇合適的微生物目標、優化前處理步驟、設計特異性引物和探針，并優化PCR 反應條件，以提高食品微生物檢測的準確性和效率。

1 PCR 技術在食品微生物檢測中的優勢和挑戰

1.1 優勢

①PCR 技術具有高度的靈敏性和特異性，可以檢測微生物目標的低濃度。由于PCR 反應能夠擴增目標DNA 序列，即使微生物目標在食品樣品中的濃度非常低，也能夠通過PCR 放大到足夠的數量進行檢測。同時，通過正確設計引物和探針，可以確保PCR 反應的特異性，只檢測特定的微生物目標，避免誤報和交叉反應。②PCR 能夠在短時間內完成目標DNA 的擴增和檢測。PCR 反應的周期時間可以在幾小時內完成，有效提升食品微生物檢測速度，提供及時的結果。③PCR 技術可以通過前處理步驟去除樣品中的抑制物質，并通過擴增目標DNA 的方法，克服復雜樣品的困難，提供更可靠的檢測結果[1]。

1.2 挑戰

①食品樣品的復雜性和多樣性，是PCR 技術在食品微生物檢測中面臨的挑戰之一。不同食品樣品的成分和特性各不相同，可能導致樣品前處理和DNA 提取過程困難。②樣品中的抑制物質和基質干擾可能影響PCR 反應的效果，導致假陰性或假陽性結果。因此，在PCR 技術中，檢測人員需要考慮抑制物質的存在，并采取相應措施減輕其影響，如優化DNA 提取方法和使用特殊試劑來消除抑制物質。③PCR 技術在食品微生物檢測中需要特定的實驗室設備和技術要求，包括溫控設備、PCR儀器、核酸提取設備和引物設計軟件等。④PCR 技術需要熟練的試驗操作和技術知識，以確保PCR 反應的可靠性和重復性[2]。

2 PCR 技術在食品微生物檢測中的戰略應用

PCR 技術作為一種強大的分子生物學工具，已經在食品微生物檢測領域展現了廣泛的應用前景。其在食品安全保障中的戰略性應用，不僅可以提高檢測的靈敏度和特異性，還可以加速檢測過程，從而更好地滿足快速鑒定和檢測的需求。

2.1 靶標選擇與設計策略

2.1.1 靶標基因的重要性與選擇原則

在食品微生物檢測中運用PCR 技術時，靶標基因的選擇是確保檢測結果準確性和可靠性的關鍵因素。具體而言，靶標基因作為PCR 擴增的目標，在決定檢測靈敏度和特異性的同時，也影響著分析的可行性和實用性。合理選擇靶標基因可以使PCR 技術更好地適應不同食品樣品的微生物檢測需求。通常情況下，選擇在目標微生物中具有高度保守性和特異性的基因片段作為靶標是必要的。其中，保守性指的是基因在不同菌株中的序列保持相對穩定，以確保在多樣的微生物群體中同樣能被擴增；特異性是確保引物和探針僅與目標微生物的基因序列匹配，避免與其他非目標微生物的DNA 片段發生交叉反應。作為一個成功的靶標基因，16S rRNA 基因在大多數細菌中具有高度保守性，因此被廣泛應用于微生物鑒定。這一基因區段在細菌中扮演重要的生物學功能，其序列在不同菌株之間的變異性相對較小，使其成為微生物分類學和鑒定的理想選擇。

2.1.2 引物與探針設計的考慮因素

靶標基因片段的交叉反應，是在PCR 技術中需要謹慎考慮的重要問題之一。在食品微生物檢測中，可能存在多種微生物種類，其基因組中的某些片段可能相似，導致引物與非目標微生物的DNA 產生交叉反應。這種交叉反應可能導致假陽性結果，從而誤導檢測結果。因此，在選擇引物時，檢測人員需要特別關注其獨特性和特異性。其中，引物的獨特性和特異性可以通過生物信息學工具進行預測和分析。在引物設計的初期，檢測人員可以使用多序列比對分析，比較目標微生物和非目標微生物的基因序列，找到具有較高特異性的區域作為引物的擴增目標。探針設計應考慮以下因素。①特異性結合：探針的序列應該與引物擴增產物的特定區域相匹配，從而實現特異性結合。這可以通過確保探針序列僅與目標基因序列的特異性部分匹配來實現。②獨特性：與引物一樣，探針的序列應該在目標微生物和非目標微生物中具有足夠的獨特性，以避免交叉反應。生物信息學工具可以用來分析可能的交叉反應情況。③標簽的選擇：探針上的熒光標簽和探針的修飾，對于檢測的靈敏度和特異性有影響。熒光標簽應具有穩定性和高信號強度，以確保在PCR反應中可靠地檢測到信號。

2.2 樣本處理與前處理策略

2.2.1 樣本來源與處理的挑戰

在食品微生物檢測中，樣本的來源和處理是影響PCR 技術應用的重要因素之一。食品樣本的復雜性可能對PCR 的準確性和靈敏度產生影響。不同食品類型的樣本可能包含不同的成分，如脂肪、蛋白質、糖類等，這些成分可能干擾PCR 反應，影響檢測結果的可靠性。此外，食品樣本中可能還存在各種抑制因子，如多種化學物質、酶抑制劑等，也可能阻礙PCR 擴增的進行。這些樣本復雜性帶來的挑戰需要在樣本處理過程中克服，以確保PCR 反應的可靠性和準確性。否則，可能會導致假陰性或假陽性的結果，影響食品微生物檢測的準確性[3]。

2.2.2 去除抑制因子的方法與策略

為了克服食品樣本中的抑制因子，樣本前處理過程至關重要。當前，有多種方法和策略可以幫助減少抑制效應，保障PCR 檢測的準確性[4]。①使用特定的提取試劑盒：不同的提取試劑盒可以針對不同食品類型的樣本特性，選擇適當的方法進行核酸提取，以有效分離核酸，并去除一些抑制因子。②酶處理：酶的加入可以在核酸提取過程中分解一些抑制性物質，如蛋白質酶、脂肪酶等，有助于減少抑制效應，提高PCR 反應的成功率。③離心：通過離心操作，可以將樣本中的固體顆粒沉淀，分離出液相，從而降低抑制性物質的含量。④稀釋樣本：對于特別濃縮或含有高濃度抑制因子的樣本，可以進行適當的稀釋，從而降低抑制效應。⑤內標物質的使用：內標物質是已知的DNA 片段，與待測的目標基因一起擴增。內標物質的存在可以幫助判斷PCR 反應是否受到抑制，從而驗證結果的可靠性。

2.3 反應條件優化策略

2.3.1 溫度循環參數的優化與穩定性

PCR 反應的溫度循環參數對于擴增效率和產物特異性具有重要影響。①在PCR 過程中，溫度循環通過不同溫度階段的切換來實現DNA 的變性、退火和延伸。因此，優化這些溫度循環參數可以顯著提高PCR 反應的效率和準確性。通過調整退火溫度，可以確保引物在目標DNA 序列上結合的特異性。②延伸時間的優化也至關重要。延伸時間應足夠長，以確保DNA 聚合酶充分擴增目標序列，同時也應避免過長的延伸時間，以免引起非特異性擴增或引物的降解。③擴增周期數的選擇取決于起始DNA 模板的初始濃度以及所需的擴增量。適當的周期數可以在不引起副產物的情況下達到足夠的擴增。

2.3.2 反應體系組成的調控與優化

①PCR 反應體系的組成是影響PCR 反應效率和產物穩定性的重要因素之一。合理的反應體系組成可以確保引物和核酸模板之間的充分結合，以及酶的高效催化。在反應體系中，核酸模板的濃度應該處于合適的范圍內，以確保擴增的效率和特異性。引物和探針的濃度也需要經過優化，以避免過高或過低的濃度對反應的影響。②反應體系中，緩沖液的選擇和濃度影響pH 值的穩定，從而影響酶的活性。適當添加酶抑制劑可以防止酶在PCR 反應開始前不受控制的活性，從而保證反應的穩定性[5]。

2.4 數據分析與結果解釋策略

2.4.1 分析PCR 產物的方法與工具

當前，有多種方法和工具可以用于分析PCR 產物。①凝膠電泳是一種常用的分析方法，通過將PCR 產物在凝膠中進行電泳分離，可根據產物的大小判斷PCR擴增是否成功。然而，凝膠電泳能夠提供關于PCR 產物大小的信息，但無法進行定量分析。②毛細管電泳是一種高效分離和定量分析PCR 產物的方法。它通過在毛細管中進行電泳分離，根據PCR 產物的大小和電荷來分析樣品。③實時熒光PCR 是一種廣泛應用于PCR 分析的技術。它可以提供實時監測PCR 產物積累量的信息，通過熒光信號的強度來反映目標基因的豐度。實時熒光PCR 可以用于定量分析，計算閾值周期數（Ct 值），從而比較不同樣本中目標基因的數量。④數據分析工具和軟件，在PCR 產物分析中扮演著重要角色。這些工具可以用于解釋實時熒光PCR 的結果，繪制熒光曲線和標準曲線，計算Ct 值以及進行樣品間和批次間的比較與分析。

2.4.2 結果的可靠性和準確性的驗證

為了確保PCR 結果的準確性和可靠性，需要進行嚴格的驗證步驟。①陽性和陰性對照樣本：陽性對照樣本可以包含已知目標基因序列，用于驗證PCR 的靈敏度和特異性。同時，陰性對照樣本可以用于檢測是否存在潛在的污染。②重復性試驗：進行多次獨立的PCR試驗，可以驗證結果的可重復性和穩定性。通過比較不同試驗之間的結果，可以評估PCR 反應的一致性和穩定性。③平行試驗：同時進行多個平行試驗，可以評估試驗的一致性，幫助排除試驗中可能的隨機誤差。通過上述驗證步驟，可以確保PCR 檢測結果的可靠性和準確性，有助于排除假陽性和假陰性結果，提高PCR 技術在食品微生物檢測中的可信度和應用價值。

3 結語

綜上所述，PCR 技術在食品微生物檢測中具有巨大的潛力和廣泛的應用前景。隨著技術的不斷發展和改進，PCR 技術將在食品微生物檢測中發揮越來越重要的作用，為人們提供更加可靠和高效的食品安全保障。