偎膿長肉法通過Notch4促進巨噬細胞M2型極化對肛周膿腫術后創面的影響*

夏友光 令狐慶 黃 奚

肛周膿腫是指肛管直腸周圍間隙或軟組織發生的急性或慢性化膿性感染,多因局限性膿液積聚而引起[1]。流行病學調查顯示,肛周膿腫的發病率約為2%,好發于20～40歲的男性,約占肛腸疾病的三分之一[2,3]。目前,手術治療是肛周膿腫的首選方法,但是術后創面大,加之肛周部屬于污染區域,容易導致術后愈合不佳。因此,如何快速促進創面愈合已成為臨床研究的熱點。

炎癥階段在術后創面愈合中發揮重要作用,炎癥可以將巨噬細胞等炎癥因子募集于創面,產生生長因子,進而促進新生組織填補創面缺損[4,5]。巨噬細胞可分為促炎型(M1型)和抗炎型(M2型);M1型巨噬細胞在創面的早期階段會分泌大量的炎癥因子,清除壞死組織及病原體,加速創面炎癥反應的進程[6];當創面局部炎癥反應得到一定控制后,M1型巨噬細胞會轉為M2型,起到合成和分泌蛋白質作用,從而促進創面血管新生、組織修復[7]。研究表明,Notch信號通路在調控上皮巨噬細胞募集及血管內皮細胞再生中起著重要作用;同時,Notch信號還是巨噬細胞生物學功能的關鍵調節器[8,9]。

偎膿長肉法為中醫治療瘡面的特色外治法。研究證實,偎膿長肉法通過藥瘡交互作用,刺激局部細胞因子增殖,從而促進創面肉芽化,加速創面修復[10]。太乙斂瘡散是筆者科室根據多年臨床經驗創制的偎膿長肉外用藥,常用于促進肛腸疾病術后創面愈合。有研究顯示,偎膿長肉法可以調節M1/M2型巨噬細胞比例,促進創面血管化,加速膠原沉積和創面愈合,但是具體機制尚不明確[11]。本實驗擬通過建立肛周膿腫術后大鼠模型,旨在觀察偎膿長肉法對術后創面的影響,并探討其作用是否通過靶向Notch信號調控巨噬細胞來完成。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SD雄性大鼠40只,體質量220～250 g,8周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號:SCXK(滬)2017-0005],飼養于徐州醫科大學實驗動物中心SPF級動物房,溫度22～26 ℃,相對濕度為45%～58%,動物實驗操作符合3R原則。實驗方案經徐州市中醫院實驗動物道德倫理委員會批準。

1.2 藥物及制備太乙斂瘡散由玄參、白芷、當歸、赤芍、大黃、生地黃、土鱉蟲、血余炭、乳香、沒藥組成,經物理粉碎加工并過120目篩,通過紫外線滅菌法處理、無菌水調和;所有中藥均購自徐州市中醫院中藥房。龍珠軟膏(馬應龍)購自徐州市中醫院西藥房(規格:10 g,批準文號:國藥準字 Z10950017,馬應龍藥業集團股份有限公司)。

1.3 主要試劑與儀器Notch4、Hes1抗體(美國Abcam公司,批號ab95776、ab71559);IL-4、TNF-α、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、CD206 ELISA試劑盒(美國Abcam公司,批號ab100710、ab208348、ab253219、ab281180);蘇木精-伊紅染色試劑(珠海貝索生物技術有限公司,批號:BA4056);Trizol試劑盒(TaKaRa公司,批號:7233)。

全自動石蠟切片機(金華華速科技有限公司,型號HS3345);Multiskan全波長酶標儀(美國Fermentas公司,型號:MK3);E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Thermo Scientific公司,型號:E-Gel Imager)。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立和分組采用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進行麻醉處理,碘伏常規消毒,局部備皮,于大鼠背部形成直徑約2 cm的創面傷口,傷口深度直達肌層,止血后在創面滴加大腸埃希菌標準菌株(購自南京便診生物科技有限公司)0.1 ml,縫合傷口,48 h后拆線,如傷口有膿性分泌物出現即為造模成功。將成功建立的30只大鼠分為模型組、馬應龍組、偎膿長肉組,每組10只。另選取10只僅有創面傷口不滴加大腸埃希菌標準菌株的大鼠作為對照組。

2.2 給藥所有大鼠均進行常規飼養,每日常規換藥。除對照組外,其余各組在每次換藥前半小時均需在創面滴加0.1 ml大腸埃希菌標準菌株。對照組和模型組大鼠予無菌生理鹽水紗布外敷并固定;馬應龍組大鼠創面給予等面積的馬應龍完全覆蓋創面,其上蓋無菌紗布并固定;偎膿長肉組大鼠創面給予等面積的太乙斂瘡散完全覆蓋創面,其上蓋無菌紗布并固定;所有大鼠均每天換藥1次,連續干預14 d。

2.3 檢測指標

2.3.1 創面愈合情況將造模開始時創面面積作為基礎創面面積,每組取3只大鼠,分別于治療后第3、7、14天測量創面面積,創面愈合率=(基礎創面面積-未愈合創面面積)/ 基礎創面面積×100%。

2.3.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測選取治療后第7、14天各組大鼠愈合創面的組織切片,經脫蠟、水化后行常規HE染色,于光學顯微鏡下觀察創面組織病理學變化情況。

2.3.3 ELISA法檢測療程結束后按IL-4、TNF-α試劑盒說明書檢測各組大鼠血清IL-4、TNF-α水平;按iNOS、CD206 ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠愈合創面中iNOS、CD206含量。

2.3.4 蛋白免疫印跡(WB)檢測將各組大鼠愈合創面組織進行充分勻漿,加入細胞裂解液后以 12 000 r/min 離心10 min,取上清液測定蛋白量。取待測樣品進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,并進行轉膜、封閉;分別加入一抗(Notch4、Hes1、β-Actin均1∶1000稀釋)4 ℃過夜;TBST洗滌3次后加入二抗(以1∶5000稀釋)常溫孵育2 h,TBST洗脫后曝光顯影,拍照后以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

2.4 統計學方法所有數據均采用SPSS 22.0軟件進行統計分析,符合正態分布資料以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析進行檢驗,進一步兩兩比較采用SNK檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 偎膿長肉法對模型大鼠創面愈合率的影響治療后3 d,各組大鼠創面愈合率之間差異無統計學意義(P>0.05);與對照組相比,模型組大鼠在治療后第7、14天的創面愈合率明顯減慢(P<0.05);與模型組相比,偎膿長肉組和馬應龍組大鼠創面愈合率明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠創面愈合率比較 (只,

3.2 偎膿長肉法對模型大鼠創面組織病理學的影響HE染色結果提示:治療7 d后,對照組大鼠創面可見少量瘢痕修復,有肉芽組織形成,大量炎性細胞浸潤,可見少量新生毛細血管;模型組大鼠創面組織高度水腫,表層出現壞死,少量肉芽組織形成,大量炎性細胞浸潤,成纖維細胞分布稀疏,未見明顯新生毛細血管;馬應龍組和偎膿長肉組大鼠創面有較多肉芽組織增生,可見血管增生,少量炎性細胞浸潤,創面表皮出現增生角化。治療14 d后,對照組大鼠創面形成較多成纖維細胞和膠原蛋白沉積,存在大量肉芽組織,少量淋巴細胞出現;模型組大鼠創面有少量膿性分泌物,炎性細胞浸潤明顯,創面表皮結構復雜,層次不輕,可見大量毛細血管和肉芽組織;馬應龍組和偎膿長肉組大鼠創面的上皮大部分已基本形成,成纖維細胞肥大且分布密集,膠原組織清晰可見。

3.3 偎膿長肉法對模型大鼠巨噬細胞表達水平的影響與對照組相比,模型組、馬應龍組和偎膿長肉組大鼠巨噬細胞中TNF-α、iNOS含量顯著升高(P<0.05),而IL-4、CD206含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,馬應龍組和偎膿長肉組中TNF-α、iNOS含量顯降低(P<0.05),而IL-4、CD206含量顯著升高(P<0.05)。這提示,偎膿長肉法可促進肺巨噬細胞向M2型極化。見表2。

表2 各組大鼠巨噬細胞表達比較

3.4 偎膿長肉法對模型大鼠創面組織Notch4通路相關蛋白水平的影響與對照組相比,模型組大鼠Notch4、Hes1蛋白表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,馬應龍組和偎膿長肉組大鼠Notch4、Hes1蛋白表達明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠創面組織Notch4通路相關蛋白表達比較 (例,

4 討論

由于肛周膿腫好發于肛管、直腸周圍及軟組織間隙,術后創面往往較大,加之肛門特殊的生理結構和功能,很容易出現創面污染;如果處置不當,會出現細菌和壞死組織的堆積,導致愈合時間延長[12]。西醫針對肛周膿腫術后創面的處理多采用浸有抗感染藥物的紗條填塞,輔以敷料固定,但是這種處理方式容易出現二次感染和假性愈合[13]。因此,尋求一種促進肛周膿腫術后創面快速愈合的方法已成為臨床研究熱點。

偎膿長肉法是中醫外科瘡瘍中特色治療方法,主要是將中草藥敷于創面處,通過局部皮膚和創面組織對藥物的吸收,促進局部創面分泌大量膿液,從而達到毒邪外出、腐脫新生的目的。太乙斂瘡散是筆者科室根據偎膿長肉法理論創制的院內協定方,在臨床多年運用過程中取得了滿意療效。方中白芷活血止痛、生肌排膿;大黃清熱解毒、活血祛瘀止痛、通便;血余炭善于止血、生肌補瘡;玄參、生地黃均可養陰生津;當歸既可補血,又能行血,兼之還可潤腸通便,更適合肛周膿腫術后患者;赤芍涼血消腫、散瘀止痛;土鱉蟲破血逐瘀止痛;乳香、沒藥均可活血止痛、生肌。諸藥合用,可奏去腐生肌之功。本研究結果顯示,治療干預后第7、14天,偎膿長肉組大鼠創面愈合率明顯高于模型組和馬應龍組,提示偎膿長肉法可以有效促進肛周膿腫術后創面愈合速度。HE染色結果顯示,應用太乙斂瘡散后,肛周膿腫術后大鼠創面中成纖維細胞和肉芽組織的數目明顯增多,且有大量血管增生和膠原蛋白沉積,表明偎膿長肉法可以增加肛周膿腫術后創面中膠原重塑和表皮生長速度,從而加速傷口的愈合。

炎癥階段在術后創面恢復中起著重要作用。正常狀態下,炎癥可以將巨噬細胞募集到創面,清除細胞碎片、分泌生長因子、促進基質沉積和重建,從而加速創面愈合[5]。但是在病理情況下,缺乏相應的炎癥細胞,特別是巨噬細胞,會導致創面難以愈合。巨噬細胞的功能主要有誘導炎癥和組織再生,前者由M1型巨噬細胞發揮作用,后者由M2型巨噬細胞執行[14]。研究表明,TNF-α、iNOS可用于鑒定M1型巨噬細胞,而IL-4、CD206則是鑒定M2型巨噬細胞較為理想的指標[15]。本研究中,在太乙斂瘡散干預后,TNF-α、iNOS含量顯降低,而IL-4、CD206含量顯著升高,這表明,偎膿長肉法可以誘導肛周膿腫術后模型大鼠巨噬細胞向M2型極化,進而抑制創面炎癥的進展。

巨噬細胞的極化和功能調節涉及到多種信號通路和轉錄網絡的調節[16]。有研究報道,Notch信號是巨噬細胞生物學功能的關鍵調節器,阻斷Notch信號通路有助于巨噬細胞向M2型極化[17]。另有研究顯示,Notch4靶基因Hes1的激活會促進巨噬細胞的激活,加重炎癥反應,減少向M2型極化[18]。Huang等[18]發現,Notch4及其配體在糖尿病潰瘍小鼠創面中呈現高表達;而給予Notch4抑制劑或敲除Notch4基因后,可加快小鼠潰瘍面的愈合速度。由此推測,Notch4信號通路在創面愈合過程中有著重要作用。本研究結果顯示,經太乙斂瘡散干預后,偎膿長肉組大鼠的Notch4、Hes1蛋白表達明顯降低,提示偎膿長肉法可以抑制Notch4通路活化。推測偎膿長肉法可能通過抑制Notch4信號通過促進巨噬細胞的M2型極化作用。

綜上所述,偎膿長肉法可以促進肛周膿腫術后大鼠的創面愈合率,調控炎癥因子的釋放,增加創面的成纖維細胞數目和膠原組織沉積,加速術后創面的愈合。其作用機制可能與調控Notch4信號通路,從而誘導巨噬細胞向M2型極化有關。然而本研究僅初步探討了偎膿長肉法對巨噬細胞極化的影響,后續尚需要體外細胞研究和在體動物的雙向驗證研究。