不同體色菲牛蛭體成分差異研究

賈薈瑾,楊秀娟,鄧 斌,劉藝端,許文坤,王如飛,戚 敏*

(1.云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南農業大學云南省動物營養與飼料重點實驗室,云南昆明 650201;3.云南省農村科技服務中心,云南昆明 650021;4.云南省畜牧總站,云南昆明 650224)

菲牛蛭是一種水蛭,俗名金邊螞蟥,是一種特色的藥用動物資源[1]。菲牛蛭灰分為1.33%、粗脂肪為1.35%、水分為80.55%,粗蛋白含量較高,粗脂肪含量低[2]。菲牛蛭含16種脂肪酸,占脂肪酸總量的97.39%,其中飽和脂肪酸占63.34%,不飽和脂肪酸占34.05%,含量最高的脂肪酸是十六烷酸(棕櫚酸)(達23.78%),其次是9-十八碳烯酸(油酸)占12.53%[2]。菲牛蛭體含有Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Cu、V、Cr共8種元素,其常量元素中Ca的含量較高,為14.11 mg/g,微量元素中Fe與Zn的含量較高,分別為1.33和1.37 mg/g,且菲牛蛭體內的Fe、Mg、Zn微量元素符合抗癌藥物微量元素范圍[3]。菲牛蛭含有多種活性成分,其中菲牛蛭素是蛋白質和天然抗凝血物質,與胰島素、青蒿素并稱為“世界三素”[4],通常用抗凝活性來表示菲牛蛭素的含量,抗凝活性越高,菲牛蛭素含量越高,抗凝效果也越好。現代醫學表明,菲牛蛭素可治心腦血管疾病,在動脈粥樣硬化、敗血性休克、高血壓和缺乏抗凝血酶因素方面也具有巨大的優勢和廣闊的應用前景[5]。裴強等[6]采用菲牛蛭凍干粉成功治療2例急性白血病合并肺栓塞患者,目前相關研究已經通過云南省第一人民醫院醫學倫理委員會鑒定。

目前,隨著野生菲牛蛭資源的逐漸稀缺,菲牛蛭素變得愈發珍貴,高質量地提取菲牛蛭素勢在必行。近年來,國內已有許多關于品種[7]、體重[8]、飼料[9]、凍存時間[10]、部位[11]、菲牛蛭素檢測方法[12]等因素是否會對菲牛蛭體成分和抗凝活性造成影響的研究,但針對不同體表顏色是否會影響其體成分及抗凝活性未見相關報道。已知有2種體表顏色的菲牛蛭,其背部分別呈黃褐色和橄欖綠色,均有5條細密的綠黑色斑點組成的縱線,腹面淺黃色、平坦,散布不規則暗綠色斑點。該研究以菲牛蛭的2種體色作為切入點展開相關研究和討論,為菲牛蛭的進一步開發利用提供更科學完善的基礎研究數據。

1 材料

1.1 試驗動物活體體重為4.0 g左右的黃褐色和橄欖綠色菲牛蛭(各30條,健康狀況良好),由云南海瑞迪生物制藥有限公司提供。試驗在云南農業大學動物科學技術學院云南省營養與飼料重點實驗室進行。

1.2 主要試劑液氮、無水硫酸銅、無水硫酸鈉、濃硫酸、6 mol/L鹽酸水解溶液、檸檬酸鈉緩沖溶液、0.9%氯化鈉、0.5%牛纖維蛋白原緩沖液,均由云南農業大學動物科學技術學院云南省營養與飼料重點實驗室提供。

1.3 主要儀器冷凍干燥機(型號FD-1C-50),購自北京博醫康實驗儀器有限公司;全自動凱氏定氮儀(型號SKD-1000),購自上海沛歐有限公司;pH計(型號pHS-3D),購自上海精密科學儀器有限公司;氨基酸全自動分析儀(型號A300),購自德國曼默博爾公司。

2 方法

2.1 試驗動物分組將試驗所用菲牛蛭按體表顏色平均分為2組,每組3個重復,每個重復10條。

2.2 試驗前處理將菲牛蛭稱重后,放入液氮處死,然后用不銹鋼粉碎機粉碎,于FD-1C-50冷凍干燥機冷凍干燥后稱重[13],備用。

2.3 水分的測定水分含量采用冷凍干燥法測定。

式中:X為水分含量(%);Ma為稱量皿的重量(g);Mb為樣品+稱量皿的重量(g);Mc為凍干后樣品+稱量皿的總重(g)。

2.4 蛋白質的測定使用全量凱氏定氮法。稱0.2 g樣品(準確至0.000 1 g)于消化管中,加入無水硫酸鈉、硫酸銅和濃硫酸消化,用SKD-1000上海沛歐全自動凱氏定氮儀測定,當溶液顏色由藍色變為淺紅色時即為滴定終點,記下此時硫酸標準溶液的體積用量。

式中:V0為滴定空白樣時的硫酸用量,mL;V1為滴定樣品時的硫酸用量,mL;0.014為1 mL鹽酸標準滴定溶液(c=1.000 mol/L)相當的、以克表示的氮的質量標準硫酸的濃度;c為標準硫酸的濃度,mol/L;6.25為氮換算成蛋白質的平均系數;m為樣品質量,g。對樣品和空白對照作2次平行測定,結果為算術平均值。

2.5 水解氨基酸的測定采用氨基酸全自動分析儀柱后衍生法測定。樣品預處理為酸水解:稱取100 mg樣品于20 mL安瓿瓶中,加10 mL 6 mol/L鹽酸水解溶液封管,(110±2)℃恒溫干燥箱水解24 h。冷卻、混勻、過濾,用移液管取適量濾液于濃縮器中60 ℃抽真空蒸發。加3～5 mL檸檬酸鈉緩沖溶液,搖勻,4 000 r/min離心,取上清液上機測定。

定量測定及結果計算公式:

式中:n為樣品水解溶液稀釋倍數;Ai為樣品溶液對應氨基酸峰面積;V為樣品水解溶液體積,mL;c為標準工作溶液對應氨基酸濃度,nmol/mL;M為氨基酸摩爾質量,g/mol;Vst為氨基酸標準溶液進樣體積,μL;Ast為氨基酸標準溶液對應氨基酸峰面積;m為樣品質量,mg;Vi為樣品溶液進樣體積,μL。

2.6 抗凝活性的測定通過凝血酶滴定法測定。稱量(0.10±0.000 1)g菲牛蛭素凍干粉并加入3 mL 0.9%NaCl,混合并浸提30 min,4 000 r/min離心20 min,上清液收集100 μL。加入0.5% 200 μL牛纖維蛋白原緩沖液,混合,并在37 ℃水浴中以5 μL/min滴加凝血酶并輕輕搖動直至形成絮狀沉淀或凝固,記錄滴定度。1個ATU等于中和1個NIH凝血酶所用菲牛蛭素質量。

抗凝血酶活性(U/g)=

2.7 數據的統計分析采用Spss19.0軟件對試驗數據進行統計分析,試驗數據以“平均值±標準差”表示,采用F檢驗對菲牛蛭中的水分、粗蛋白質、水解氨基酸及抗凝活性的結果進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

3 結果與分析

3.1 不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質含量分析按照“2.3水分的測定”及“2.4白質的測定”方法測定菲牛蛭水分和粗蛋白質,其含量見圖1。圖1表明,不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質含量差異不顯著(P>0.05)。

注:小寫字母相同代表差異不顯著(P>0.05)。Note:The same lowercase indicates the difference is insignificant(P>0.05).圖1 不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質含量Fig.1 Moisture and crude protein content of Hirudinaria manillensis with different body colors

3.2 不同體表顏色菲牛蛭氨基酸含量分析按“2.5”處理方法對不同體表顏色菲牛蛭的氨基酸含量進行測定,氨基酸標準品圖譜、氨基酸樣品圖譜、氨基酸含量比較見圖2、3及表1。

圖2 氨基酸標準品圖譜Fig.2 Atlas of amino acid standards

圖3 氨基酸樣品圖譜Fig.3 Atlas of amino acid samples

結果表明:黃褐色菲牛蛭的精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、藥用氨基酸、呈味氨基酸、藥用氨基酸與總氨基酸比值、呈味氨基酸與總氨基酸比值均較橄欖綠色菲牛蛭顯著升高(P<0.05);黃褐色菲牛蛭的丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸較橄欖綠色菲牛蛭顯著降低(P<0.05)。

表1 不同體表顏色菲牛蛭氨基酸含量比較Table 1 Comparison of amino acid content of Hirudinaria manillensis with different body colors 單位:mg/g

3.3 不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性分析圖4表明,不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性差異顯著(P<0.05),其中黃褐色菲牛蛭抗凝活性比橄欖綠色菲牛蛭高37.00%。

注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicate significant difference(P<0.05).圖4 不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性Fig.4 Anticoagulant activity of Hirudinaria manillensis with different body colors

4 結論與討論

4.1 菲牛蛭中氨基酸影響因素分析天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、精氨酸這9種氨基酸人體自身不能合成,但人體需要它們維持氮平衡,因此被稱為藥用氨基酸。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸具有鮮味,通常被稱為呈味氨基酸。

苗艷麗等[3]采用內標法對廣西科康生物有限公司生產的菲牛蛭干品氨基酸含量進行測定,發現其含有16種氨基酸,包括8種必需氨基酸,但由于產生峰重疊,未檢出纈氨酸和蛋氨酸。陳琛等[4]發現,菲牛蛭氨基酸組成比例中必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為36.87%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為58.41%,符合FAO/WHO推薦值,具有良好的氨基酸組成比。劉麗芳等[14]采用HPLC-柱后衍生法研究寬體金線蛭氨基酸組成的差異,發現炮制前氨基酸總量為73.94%,含量最高的是亮氨酸,其次是纈氨酸,谷氨酸含量最低。對比發現,兩種體表顏色菲牛蛭總氨基酸含量均高于寬體金線蛭。楊秀娟等[8]對不同體重菲牛蛭氨基酸含量進行差異顯著性研究,結果發現不同體重菲牛蛭的天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸6種氨基酸和水解氨基酸總量有顯著差異(P<0.05),而藥用氨基酸含量差異不顯著(P>0.05)。該研究關于兩種體表顏色菲牛蛭的水解氨基酸研究結果表明,黃褐色菲牛蛭藥用氨基酸含量、呈味氨基酸含量均高于橄欖綠色菲牛蛭。以上研究表明,品種、體重、顏色均對水蛭氨基酸含量及比例有一定影響。該研究創新之處在于首次將顏色作為影響菲牛蛭氨基酸含量的因素納入考慮范圍,具有一定的新穎性和獨特性,可為菲牛蛭的進一步開發利用提供基礎研究數據。

4.2 菲牛蛭中抗凝活性影響因素分析針對使用不同的水蛭素提取工藝和檢測方法得到的水蛭素含量不同這一問題,近年來有相關的研究和討論。張彬等[15]分別采用3種不同的提取方法(即鹽浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法)和凝血酶滴定法對3種地方的野生菲牛蛭(廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭和海南菲牛蛭)和2種飼料飼養的菲牛蛭(野生和養殖菲牛蛭)的抗凝活性進行測定,發現不同飼料飼養的菲牛蛭抗凝活性無顯著差異(P>0.05),說明人工養殖不會影響菲牛蛭的抗凝活性。何夢雪等[16]用凝血酶滴定法比較不同提取方法對菲牛蛭抗凝活性成分的分離作用,發現鹽浸提法比水提法、水提醇沉法、丙酮法更好。因此該試驗采用鹽浸提法和凝血酶滴定法提取菲牛蛭樣品中的菲牛蛭素以及比較不同體表顏色菲牛蛭中抗凝活性的差異有一定的科學依據,但提取和滴定方法不同,得出的結果可能會有差異。兩種體表顏色菲牛蛭的水解氨基酸、抗凝活性存在差異。黃褐色菲牛蛭藥用氨基酸含量、呈味氨基酸含量和抗凝活性比橄欖綠色菲牛蛭高(P<0.05)。