乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性與急性腦梗死的相關(guān)性研究

司英麗,張冬青

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科,北京 100048

腦卒中是腦血管疾病中的常見病和高發(fā)病,全球疾病負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)分析表明,腦卒中的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)[1]。隨著我國(guó)老齡化加劇,腦卒中的發(fā)病率也快速上升,其中急性腦梗死(ACI)占比較大[2],嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。ACI是指由各種原因?qū)е碌哪X血管狹窄,甚至閉塞,而引起腦組織缺血、缺氧性改變,進(jìn)而造成局部區(qū)域腦組織功能缺損的癥狀和體征[3]。ACI具有較高的致殘率及致死率,且多發(fā)于中老年人,嚴(yán)重危害其生命健康[4],給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[5-6]。乙醛脫氫酶2(ALDH2)參與乙醇的代謝,能夠促進(jìn)毒性中間產(chǎn)物乙醛和4-羥基壬烯醛(4-HNE)的轉(zhuǎn)化,具有明確的解毒作用,ALDH2可能通過清除毒性代謝醛類等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。有研究表明,ALDH2編碼基因多態(tài)性及氧化應(yīng)激產(chǎn)物4-HNE水平升高是腦卒中的易感因素[8],并認(rèn)為4-HNE可能是缺血性腦卒中的潛在生物標(biāo)志物之一[9]。本研究對(duì)不同臨床分組的ACI患者和健康人群的ALDH2基因多態(tài)性進(jìn)行分析,觀察ALDH2基因多態(tài)性在ACI患者中的分布情況,以期為臨床提供參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年8月至2021年8月在本院神經(jīng)內(nèi)科就診的130例ACI患者作為ACI組,其中男96例,女34例;年齡48～82歲,平均(66.3±11.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合中華神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)制定的ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];(2)均為初次發(fā)病;(3)均經(jīng)CT或MRI檢查,有頸動(dòng)脈系統(tǒng)和(或)椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)的癥狀和體征。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)腦實(shí)質(zhì)出血、出血性腦梗死、高血壓腦病、短暫性腦缺血發(fā)作者;(2)近3個(gè)月內(nèi)使用過抗癲癇藥物、多巴胺類藥物者;(3)存在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全及心力衰竭、感染者。根據(jù)頭顱CT或MRI檢查結(jié)果所示病灶大小將ACI組進(jìn)一步分為腔隙性腦梗死組(33例,病灶最大徑小于1.5 cm)、小梗死組(41例,病灶最大徑1.5～3.0 cm,≥1個(gè)腦解剖部位)和大梗死組(56例,病灶最大徑大于3.0 cm,≥2個(gè)腦解剖部位)。另選擇同期體檢中心130例體檢健康者作為對(duì)照組,其中男93例,女37例,年齡49～80歲,平均(64.3±7.3)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對(duì)象及其家屬均知情同意本研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 使用主要儀器包括LightCycler?480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)儀(瑞士Roche公司)、全自動(dòng)生化分析儀Roche cobas c701(瑞士Roche公司),使用主要試劑盒包括血液基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、ALDH2基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)有限公司)、4-HNE檢測(cè)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)。所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血7 mL,其中2 mL使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝,-20 ℃保存用于提取DNA;另外5 mL于2 h內(nèi)以3 500 r/min離心5 min,分離上層血清,-80 ℃冰箱保存用于檢測(cè)血清4-HNE水平。

1.3.2DNA提取 按照血液基因組提取試劑盒說明書提取DNA,使用美國(guó)Nano Drop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行核酸標(biāo)本質(zhì)量的評(píng)估和濃度的檢測(cè),選取吸光度(A260/A280nm)比值在1.7～1.9區(qū)間的標(biāo)本用于ALDH2基因多態(tài)性的檢測(cè)。

1.3.3基因多態(tài)性分析 采用PCR-熒光探針法進(jìn)行基因多態(tài)性分析,按照ALDH2基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒說明書操作,對(duì)研究對(duì)象的ALDH2基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)做空白對(duì)照和弱陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)總體系為25 μL,反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃、3 min,變性95 ℃、20 s,退火58 ℃、30 s,延伸65 ℃、45 s;10個(gè)循環(huán):變性95 ℃、20 s,退火58 ℃、30 s;雙通道采集熒光信號(hào);65 ℃、45 s,30個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1PCR-熒光探針法檢測(cè)基因型結(jié)果 ALDH2基因位點(diǎn)突變產(chǎn)生3種基因型:純合野生型GG、純合突變型AA和雜合突變型GA。檢測(cè)純合野生型標(biāo)本時(shí),FAM檢測(cè)通道(野生型)結(jié)果為陽性,VIC檢測(cè)通道(突變型)結(jié)果為陰性;檢測(cè)純合突變型標(biāo)本時(shí),FAM檢測(cè)通道結(jié)果為陰性,VIC檢測(cè)通道結(jié)果為陽性;檢測(cè)雜合突變型標(biāo)本時(shí),FAM和VIC檢測(cè)通道結(jié)果均為陽性。

2.2ACI組與對(duì)照組ALDH2基因的多態(tài)性比較 ACI組ALDH2突變基因型AA比例高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.599,P<0.05)。ACI組A等位基因頻率(29.6%,77/260)高于對(duì)照組的21.5%(56/260),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.455,P=0.035)。見表1。

表1 ACI組與對(duì)照組ALDH2基因的多態(tài)性比較[n(%)]

2.3不同病灶大小組ALDH2基因的多態(tài)性比較 大梗死組ALDH2突變基因型AA比例高于腔隙性腦梗死組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大梗死組A等位基因頻率(35.7%,40/112)高于腔隙性腦梗死組的21.2%(14/66),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.133,P<0.05)。見表2。

表2 不同病灶大小組ALDH2基因的多態(tài)性比較[n(%)]

2.4各組4-HNE水平比較 ACI組4-HNE水平為(17.79±7.62)ng/mL,高于對(duì)照組的(11.83±7.52)ng/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.348,P<0.05);腔隙性腦梗死組4-HNE水平為(16.29±8.71)ng/mL,低于小梗死組的(18.30±5.27)ng/mL和大梗死組的(18.31±8.36)ng/mL,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.225、-1.187,P<0.05)。

2.5不同基因型ACI患者的4-HNE水平比較 ACI組中ALDH2基因純合突變基因型AA患者血清4-HNE水平為(32.65±6.44)ng/mL,高于純合野生型GG患者的(13.24±3.25)ng/mL和雜合基因型GA患者的(19.89±2.39)ng/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.228、6.670,P<0.05)。

3 討 論

ACI是指腦組織的血液供應(yīng)突然中斷而造成的腦組織壞死,主要特征是起病急、病情重,表現(xiàn)為頭痛、耳鳴、嘔吐等癥狀,對(duì)人們的健康與社會(huì)的發(fā)展均造成了嚴(yán)重威脅。腦梗死的發(fā)病不僅與年齡、性別、飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等因素有關(guān),而且與遺傳因素、體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的堆積也有關(guān)。

近年來,氧化應(yīng)激學(xué)說已成為缺血性腦卒中研究的熱點(diǎn),脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)中產(chǎn)生的主要物質(zhì)是醛基類產(chǎn)物,可與細(xì)胞內(nèi)許多大分子相互作用產(chǎn)生多種化合物,導(dǎo)致DNA損傷和蛋白質(zhì)失活而對(duì)組織造成損傷[11],4-HNE多來源于不飽和脂肪酸,在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生,4-HNE大量在體內(nèi)蓄積,毒性很大,會(huì)引發(fā)各類疾病[12-13]。參與4-HNE代謝的酶系統(tǒng)主要有乙醛脫氫酶、醛糖還原酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶,其中乙醛脫氫酶的主要作用是將醛類物質(zhì)催化為酸類物質(zhì),即把有害的物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的物質(zhì)。乙醛脫氫酶包括許多種同工酶,ALDH2是代謝活性最強(qiáng)的同工酶,主要分布在人的大腦、肺、肝臟、心臟等組織,人ALDH2編碼基因位于第12號(hào)染色體,第1 510位堿基鳥嘌呤(G)被堿基腺嘌呤(A)替換,致使編碼的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼醄14],基因突變最終導(dǎo)致ALDH2結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,突變ALDH2與輔酶NAD(P)+的結(jié)合受損,其中雜合突變型ALDH2的酶活性下降,僅為正常活性的30%～40%,純合突變型ALDH2的酶活性幾乎喪失[15],因此,會(huì)導(dǎo)致4-HNE等醛基類產(chǎn)物的積累。ALDH2基因也被認(rèn)為是缺血性腦卒中及高血壓、糖尿病、大動(dòng)脈粥樣硬化的易感基因之一[16-18]。

本研究結(jié)果表明,ACI組A等位基因頻率(29.6%,77/260)高于對(duì)照組的21.5%(56/260),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.455,P=0.035)。本研究同時(shí)對(duì)各組血清4-HNE水平進(jìn)行分析,大梗死組ALDH2突變基因型AA比例高于腔隙性腦梗死組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大梗死組A等位基因頻率(35.7%,40/112)高于腔隙性腦梗死組的21.2%(14/66),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.133,P<0.05)。ACI組ALDH2基因純合突變基因型AA患者血清4-HNE水平為(32.65±6.44)ng/mL,高于純合野生型GG患者的(13.24±3.25)ng/mL和雜合基因型GA患者的(19.89±2.39)ng/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.228、6.670,P<0.05)。說明攜帶ALDH2純合突變基因與4-HNE水平升高顯著相關(guān),ALDH2純合突變基因是缺血性腦卒中的易感基因之一[19]。

綜上所述,ALDH2 G>A與ACI的發(fā)生密切相關(guān),且純合突變基因型AA與ACI的發(fā)生密切相關(guān),因此,氧化應(yīng)激產(chǎn)物4-HNE水平升高及其代謝酶乙醛脫氫酶編碼基因ALDH2位點(diǎn)多態(tài)性(即攜帶純合突變等位基因)是ACI的易感因素,然而本研究可能受環(huán)境因素和遺傳因素影響,且樣本量相對(duì)偏少,因此,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。